茯苓发酵生产条件优化及其多糖的提取分离与生物活性研究

目的:对茯苓的液体发酵进行研究,确定茯苓液体发酵的最适发酵培养基和最适培养条件;从发酵液中分离提取茯苓多糖,并对其中的胞外多糖进行纯化、结构分析和体外抗氧化活性研究。 方法:（1）采用PDA培养基进行转管培养,对6株不同来源的茯苓菌株进行活化、复壮; （2）测定发酵液pH值、还原糖含量和菌体量,绘制茯苓液体发酵生长曲线;观察记录不同固体斜面培养基菌龄对发酵适应期和对数生长期时间的影响; （3）在单因素分析（温度、转速、接种量、装液量、碳源种类和氮源种类）的基础上进行L934正交分析,优化茯苓液体发酵的发酵培养基和培养条件; （4）采用水提醇沉的方法和苯酚-硫酸法测定多糖含量,从发酵液中分别提取胞外多糖和胞内多糖,并将胞外多糖依次通过sevag法去除蛋白、透析和DEAE-52柱纯化分级得单一组分,用HPLC法检测纯度; （5）通过液相色谱、气相色谱、红外光谱、紫外光谱等方法和化学分析法初步鉴定纯化组分的组成及部分理化性能; （6）通过芬顿（Fenton）反应、邻苯三酚自氧化法、H2O2诱导红细胞氧化溶血抗脂质过氧化等方法,测定茯苓多糖的体外抗氧化性。 结果:（1）6株菌种皆生长良好,活化、复壮成功;其中ACCC50864成活率高、生长迅速,选定为下阶段试验的标准菌株。 （2）绘制出茯苓液体发酵生长曲线,并确定25日龄为最适固体斜面培养基菌龄。 （3）正交试验结果表明,茯苓发酵的最适培养条件为:温度26℃、转速140r/min、接种量10%、装液量100mL/250mL;碳源葡萄糖,浓度2.5%,氮源牛肉浸膏,浓度2%,KH2PO4/MgSO4为0.6%/0.3%,维生素B1 4mg/100mL。 （4）茯苓胞外多糖经DEAE-52分离,得到一种均一组分LLPSⅠ,经HPLC鉴定为单一组分。 （5）LLPSⅠ经IR图谱分析分析显示具有多糖的特征吸收峰,主链以β-型糖苷键连接为主;经红外和紫外综合分析表明LLPSⅠ中没有N、S元素存在,应为非氨基糖;经TLC和GC分析其单糖组成为葡萄糖（Glc）。 （6）体外抗氧化实验表明,茯苓胞外多糖具有较好的抗氧化作用。在多糖浓度为3.5mg/mL时,其对羟自由基清除率达56.2%;对超氧阴离子自由基具有一定的清除作用;当多糖浓度为5mg/mL时,对H2O2诱导的小鼠红细胞氧化溶血的抑制率可达43%;当浓度为5mg/mL时对脂质过氧化作用抑制率达到68.2%。 结论:确定了茯苓发酵的最适发酵培养基和最适培养条件;对纯化组分LLPSⅠ进行结构测定,并确定其有一定的体外抗氧化功能。