基于化学计量学的阿胶鉴别方法及黄芪谱效关系的研究

阿胶为马科动物驴Equus asinus L的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶,在临床上主要用于补血和改善微循环。阿胶传统的鉴别方法经验依赖性强,准确度较低。核磁共振法(NMR)是将核磁共振现象应用于测定分子结构的一种谱学技术,获得的图谱信息非常丰富,因此基本上代表了中药重要的整体化学组成,可以客观、全面地反映中药所含成分的特征。将NMR用于阿胶真伪鉴别的研究尚未见报道。因此,本课题采用NMR方法对中药阿胶水提液成分进行测定,结合化学计量学方法对核磁共振图谱进行模式识别,初步建立了阿胶真伪鉴别的核磁共振方法。 近年来关于中药指纹图谱与药效的关系研究(即谱效关系)已有一些进展,然而这些研究工作中大都采用HPLC指纹图谱的色谱峰面积直接和药效指标进行关联。药效活性与成分的含量密不可分,而峰面积的大小不能完全代表对应成分实际含量的大小,因而基于色谱峰面积与基于成分实际含量建立的谱效关系是否等价值得进一步探讨。本课题针对上述存在问题,采用黄芪药材标准品作为研究对象,研究在何种条件下,以指纹图谱峰面积代替成分实际含量进行谱效关系研究是等价的；在此基础上首先选用黄芪药材作为研究对象,以清除自由基活性为药效指标,对黄芪药材谱效关系进行研究,挖掘与抗氧化活性显著相关的特征峰,并为重要特征峰进行定性分析；其次进一步研究了黄芪多糖、黄芪黄酮类成分以及黄芪其它成分提取物HPLC指纹图谱与抗疲劳作用之间的谱效关系,为黄芪药材的质量控制和评价提供了参考依据。 本论文工作的研究内容主要分为以下几个方面： 1、测定了东阿阿胶、福胶、古井阿胶和伪品阿胶水溶性成分的1H-NMR图谱,通过把1H-NMR图谱分成不同的局部间隔区域,在优化后的局部间隔区域上进行PLS分析,准确地鉴别了阿胶真品和伪品；对该图谱区域所反映的物质成分信息进行了分析,结合参考文献,推测阿胶真品和伪品的物质成分差异可能来自丙氨酸,亮氨酸,赖氨酸,精氨酸,谷氨酸和脯氨酸。 2、以5种黄芪药材标准品作为研究对象,进行5因素、4水平的正交实验设计,获得各次实验组合HPLC指纹图谱和清除DPPH自由基活性。分别以指纹图谱峰面积和成分实际含量对药效指标进行多元线性回归分析,并尝试从理论上探讨在何种条件下,以指纹图谱峰面积代替成分实际含量进行谱效关系研究是等价的。结果表明：只要峰面积和对应成分实际含量的线性关系良好,可以采用色谱峰面积代替成分的实际含量进行谱效关系研究。 3、对不同产地黄芪和其提取条件采用正交实验设计,分别测定各次实验的HPLC指纹图谱和清除DPPH自由基的能力,采用偏最小二乘回归(PLSR)对黄芪药材指纹图谱与抗氧化活性相互关系进行研究。结果表明：黄芪中多数化学成分具有清除DPPH自由基的能力；采用HPLC-DAD-MS联用技术对部分色谱峰进行定性分析,根据色谱峰的质谱图和紫外光谱确定了7个色谱峰表征的可能成分,分别为毛蕊异黄酮-7-0-p-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-p-D-葡萄糖苷、2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-7-0-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素和3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷。 4、采用适当提取方法,获得黄芪多糖、黄芪黄酮类成分以及黄芪其他类成分提取物,以三类提取物为考察对象,选用U11*(114)均匀设计表安排实验,进行了抗疲劳作用实验(小鼠负重游泳实验),并测定均匀设计表中各实验组合的黄芪黄酮类成分、黄芪其他类成分的HPLC指纹图谱及黄芪总多糖含量,采用正交信号校正-偏最小二乘法(OSC-PLS)分析了黄芪提取物HPLC图谱与抗疲劳作用之间的谱效关系,结果表明：黄芪中黄酮类与其他类成分的色谱峰对抗疲劳呈增强作用,而黄芪多糖呈减弱作用。通过色谱峰的质谱图和紫外光谱,结合文献,确定了9个色谱峰可能的对应成分,分别为芳香膜菊素-7-0-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮-7-O-p-D-葡萄糖苷-6”-O-丙二酸酯、毛蕊异黄酮-7-0-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-7-0-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素和3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷。