干酪乳杆菌LCR6013中亚硝酸盐还原酶和电子供体的纯化及其协同降解亚硝酸盐作用

亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质,且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症,因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。笔者研究组前期研究发现干酪乳杆菌鼠李糖亚种LCR 6013(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)能很好地降解亚硝酸盐。但其中关键限速酶亚硝酸盐还原酶(LCR6013NiR)及其电子供体(LCR6013ElD)的性质和协同降解亚硝酸盐的机理尚未见报道。干酪乳杆菌LCR 6013经10.00 mg/L的亚硝酸钠诱导,培养液经溶菌酶破壁,粗酶溶液分别经过30%、60%饱和硫酸铵溶液分级沉淀,沉淀被溶解和透析后分别得蛋白液I和蛋白液II,再通过阴离子DEAE Sepharose Fast Flow和葡聚糖凝胶G-100层析柱分离纯化。蛋白液II纯化得LCR6013NiR,仅在加入电子供体之一的细胞色素C才能降解亚硝酸盐,每升的LCR 6013发酵液可得到0.54 mg活性酶蛋白,其LCR 6013Ni R比酶活为1851.20 U/mg,得率为2.08%,纯化后LCR6013NiR比活力提高16倍,经SDS-PAGE电泳确定LCR6013 NiR的单体分子质量约为45 ku。经过GPC确定蛋白分子质量为125 ku,LCR 6013Ni R为三聚体,可能是CuNiR。同时,由蛋白液I纯化的蛋白加入LCR6013NiR中,表现降解亚硝酸盐的活力,经鉴定为电子供体蛋白LCR6013ElD,经SDS-PAGE电泳确定LCR6013 El D的单体分子质量约为13 ku,与细胞色素C的单体分子质量相同。LCR6013ElD、细胞色素C、FeSO4和Na2SO3分别协同LCR6013Ni R能在48 h内将75.00 mg/L的亚硝酸钠完全降解,而LCR 6013ElD和细胞色素C降解效果最好。在含有LCR6013NiR的反应体系中,研究了LCR6013ElD和细胞色素C两种电子供体对LCR6013NiR降解亚硝酸盐的影响。LCR6013NiR降解亚硝酸盐的最适温度为37℃;最适pH为7.0;最适底物浓度为100 mg/m L;最适电子供体浓度为20 mg/mL;LCR6013NiR温度稳定性低,在55℃保持30 min后,亚硝酸盐降解率降到16.5%;LCR6013NiR在pH 2.0、3.0、4.0、10.0、11.0、12.0的环境中保持30 min后,LCR6013NiR亚硝酸盐的降解率都接近0;金属离子Ca2+、Mg2+能促进亚硝酸盐的降解,Ag+、Zn2+对降解亚硝酸盐有抑制作用,Fe2+对降解率影响不大。因此,电子供体分别为LCR6013ElD或细胞色素C对LCR6013NiR的酶学影响相似。