苜蓿总皂甙提取纯化工艺的研究

苜蓿总皂甙（Total of alfalfa saponins, TAS）是苜蓿属植物中含有的一类重要的生物活性成分,近年研究表明,TAS具有显著的降血脂和抗动脉粥样硬化等多种独特的生理功能。目前,国内对苜蓿皂甙的提取分离纯化工艺未见任何系统的报导。故本研究旨在此方面作一种摸索,为今后苜蓿资源的综合利用和开发奠定基础。针对苜蓿皂甙的研究基础与现状,结合具体实验条件,本文系统地研究了比色法测定苜蓿总皂甙含量的方法;用均匀设计法优选了超声提取的工艺条件,并采用正交设计优选了苜蓿总皂甙的水、醇回流提取工艺条件;以苜蓿总皂甙的静态吸附量、洗脱率和精制度为考察指标,系统地研究了大孔吸附树脂富集、纯化总皂甙类成分的吸附性能和洗脱参数以及重复使用周期等。其研究的主要结果如下: 确定了测定苜蓿总皂甙含量的比色-紫外分光光度法:以齐墩果酸（Oleanolic Acid, OA）为对照,确定出苜蓿总皂甙的最大吸收波长为545nm,测定苜蓿总皂甙含量的标准曲线方程为Y=-0.0294+0.0485X,加标回收率为98.96%,相对标准偏差RSD为2.71%,该方法快捷、精确、重现性良好。 研究和比较了三种不同的TAS提取方法:（1） 水溶液提取。在单因子实验的基础上,采用L9（3～4）正交实验确定了水溶液提取TAS的适宜工艺参数。结果表明:浸提温度70℃、浸提1.5h、浸提两次、固液比为1:30,TAS的平均得率为0.92% （2） 乙醇溶液提取。结果表明:浸提温度80℃、浸提时间2.0h、乙醇含量70%、固液比为1:20时TAS的得率最高,平均为1.56%。（3） 超声波提取。采用U8（8～4）均匀发计实验,结果表明:超声频率和溶剂的用量对TAS的得率有极显著的影响（α=0.01）,乙醇浓度和超声时间有显著性影响（α=0.05）。超声频率30kHz,溶剂的用量30倍,乙醇浓度70%、超声时间10min后,TAS得率为2.30%。三种提取方法中,超声法的TAS得率最高,其次是乙醇溶液提取法,而水溶液提取法最低。 探讨了大孔吸附树脂法对TAS分离纯化的影响。实验选择了七种大孔树脂为实验材料,研究和分析了各自对TAS的吸附和解吸性能。结果表明:X-5大孔树脂适于TAS的分离和精制,饱和吸附量可达34.09mg/g;X-5树脂的吸附条件:溶液pH值为5.0、上样液盐离子浓度为1.0mg/ml、上样流速为3BV/h、解吸液流速为2BV/h;通过正交实验及方差分析确定了苜蓿总皂甙分离富集的最佳操作条件为:上样浓度8mg/ml,色谱柱的径高比1:7,浸膏量—树脂比例1:3。采用5BV水溶液以2BV/h流速淋洗后,再以5BV50%的乙醇溶液以2BV/h的流速解吸,可较好地分离TAS,解吸率和精制率分别为89.9%和348.45%。TLC鉴定结果表明纯化后的产品中含有苜蓿皂甙类成分。 用最佳工艺流程提取分析了国内外20个苜蓿品种中总皂甙的含量,国外苜蓿品种的平均总皂甙含量为1.61%,国内苜蓿品种的平均总皂甙含量为2.22%。 综上所述,采取超声提取、大孔吸附树脂等工艺新技术可以有效的提高TAS这一有效成分的提取分离效率,在研制开发TAS相关产品中加以推广应用是可行的。