衰老(Aging)是生物个体随年龄增长而发生的不可逆的退行性变化。目前,人口老龄化已成为全球性的社会问题。为了延缓衰老,临床上常使用一些合成的抗氧化剂来清除体内自由基及代谢废物,但长期用药会对机体产生毒副作用。因此,探索和开发天然抗氧化剂对于延缓衰老具有重要意义。糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种全球性的内分泌代谢疾病,常伴随着各种急慢性并发症的发生,致死率高。目前,糖尿病的主要治疗方法包括注射胰岛素和口服降血糖药物,但这些方法在长期使用中会产生毒副作用,因此,寻找高效、无毒的天然降血糖药物仍是医学界的重要研究课题。杏鲍菇[Pleurotus eryngii(DC.etFr.)Quel.]是我国广泛栽培的一种食药兼备的珍稀蕈菌,具有丰富的营养价值和广泛的生物活性。本课题以杏鲍菇(P.eryngii)为出发菌株,进行液体深层发酵获得菌丝体。通过水提醇沉法获得杏鲍菇菌丝体多糖(P.eryngii mycelia polysaccharides,PMPS),分离纯化后得到PMPS-1和PMPS-2,并对两种多糖的结构及其抗衰老、抗糖尿病的生理活性进行研究,研究结果如下:(1)杏鲍菇菌丝体多糖的提取及分离纯化:为保持多糖的生物活性,采用较为温和的水提醇沉法提取多糖,去蛋白处理后,PMPS得率为22.89±1.73mg/g。采用DEAE-52纤维素离子交换柱层析和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析对PMPS进行分级纯化,得到纯化组分PMPS-1和PMPS-2,得率分别为463.42±25.09mg/g和287.65±16.71mg/g。(2)杏鲍菇菌丝体多糖的结构测定:(1)紫外扫描光谱(Ultraviolet spectrum)分析结果表明,PMPS-1和PMPS-2均不含蛋白质和核酸。(2)高效液相色谱(High pressure liquid chromatograph,HPLC)分析结果表明,杏鲍菇PMPS-1为不均一多糖,重均分子量(Weight-average molecularweight,Mw)为3.24×10～5Da;杏鲍菇PMPS-2为均一多糖,Mw为1.95×10～4Da。(3)气相色谱(Gas chromatograph,GC)分析结果显示,PMPS-1含有甘露糖和葡萄糖,其质量分数为12.13%和87.87%,摩尔比为1.00:7.24;PMPS-2含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖,其质量分数为3.21%、17.47%、14.66%和64.66%,摩尔比为1.00:4.54:3.81:16.79。(4)红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析结果显示,PMPS-1和PMPS-2均为β-型糖苷键连接的呋喃糖。(5)扫描电镜结果说明,PMPS-1分子量较大,可能具有长链结构或多分枝结构,分子之间作用力较小,易产生交叉粘连;PMPS-2分子量较小,分子间相互作用力相对较大,可能形成紧密的结构。(3)杏鲍菇菌丝体多糖抗氧化及抗衰老功效:(1)体外抗氧化试验表明,杏鲍菇PMPS-1和PMPS-2具有清除羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的能力。PMPS-2的抗氧化能力强于PMPS-1,可能与PMPS-2具备较低的分子量、单糖组成中含有木糖和半乳糖等结构特征相关。(2)体内抗氧化试验证明,杏鲍菇PMPS-1和PMPS-2可以显著抑制小鼠体重和胸腺指数的异常降低,提高组织器官中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)和总抗氧化能力(Total antioxidant capability,T-AOC)活性,降低丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,提高皮肤组织含水率及羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)含量,表明PMPS-1和PMPS-2具有较强抵制氧化应激的活性。(3)对肝脏、大脑、皮肤和胸腺的组织病理学观察结果表明,PMPS-1和PMPS-2能够减少组织中坏死及凋亡细胞的数量,缓解氧化应激对组织器官的病理性损伤。(4)杏鲍菇菌丝体多糖降血糖及抗糖尿病功效:(1)体外试验表明,PMPS-1和PMPS-2对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制活性,且PMPS-2的抑制效果强于PMPS-1。(2)对小鼠空腹血糖的影响:PMPS-1和PMPS-2灌胃处理能够降低糖尿病小鼠血糖水平。(3)对小鼠氧化应激的影响:PMPS-1和PMPS-2均能显著抑制糖尿病小鼠肝脏、肾脏和胰脏组织中SOD、GSH-Px、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和T-AOC活性的降低及脂质过氧化物(Lipid peroxide,LPO)和MDA水平的升高,对氧化应激引起的肝脏、肾脏和胰脏的损伤有较强的保护作用。(4)对小鼠脂代谢的影响:PMPS-1和PMPS-2能显著抑制糖尿病小鼠血清中甘油三酯(Triacylglycerols,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(Very low-density lipoprotein cholesterol,VLDL-C)水平的升高以及高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平的降低,表明杏鲍菇菌丝体多糖能够改善小鼠的脂代谢紊乱情况。(5)对小鼠血清中炎症因子的影响:PMPS-1和PMPS-2能显著抑制糖尿病小鼠血清中核转录因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平的升高,说明杏鲍菇菌丝体多糖能够减轻糖尿病小鼠机体的炎症反应。(6)杏鲍菇菌丝体多糖对糖尿病小鼠器官的修复作用:PMPS-1和PMPS-2可显著降低小鼠血清中的谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate transaminase,AST)的活性,降低尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(Creatinine,CRE)的水平,提高白蛋白(Albumin,ALB)水平,抑制器官指数的升高,以及减轻小鼠肝脏、肾脏和胰脏的病理学损伤,说明杏鲍菇菌丝体多糖能够在高糖状态下保护肝脏、肾脏和胰脏免受损伤。上述结果表明,PMPS-1和PMPS-2具有体外和体内抗氧化活性,能够减轻氧化应激损伤,延缓衰老;同时能改善糖尿病小鼠的糖代谢和脂代谢,减轻氧化应激和炎症反应对机体的损伤,对糖尿病及其并发症有预防和治疗作用。
