炎症是一种复杂的病理过程,它与肿瘤、糖尿病、心血管疾病、阿尔兹海默症等众多重大疾病的发生发展都有着密切关系。蜜环菌具有良好的药用功效,主要用于神经性头痛、癫痫、惊风等神经系统疾病的治疗,这类疾病的发病机制可能与神经系统的炎症反应有关,这提示我们,蜜环菌可能具有一定的抗炎活性,而关于蜜环菌抗炎活性的研究甚少。本论文旨在利用脂多糖(LPS)诱导的体外炎症模型评价蜜环菌提取物的抗炎活性,从中筛选出具有良好抗炎活性的组分,探索该组分的抗炎作用机制以及化学成分组成,为开发蜜环菌的抗炎应用提供依据。主要研究结果如下:(1)制备了蜜环菌不同极性萃取物并评价了其抗炎活性。首先制备了蜜环菌正己烷(Hex)、氯仿(Chl)、乙酸乙酯(EtOAc)及正丁醇(But)萃取物,得率分别为(1.90±0.02)%、(1.10±0.08)%、(1.28±0.03)%、(8.11±0.12)%;再以LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7所构建的系统性炎症模型和LPS诱导小鼠小胶质细胞BV-2所构建的神经性炎症模型为研究对象,检测不同萃取物对细胞增殖、炎症介质一氧化氮(NO)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)等炎症因子分泌量的影响,结果发现蜜环菌EtOAc萃取物的效果最佳,其在浓度0-300μg/m L范围内可显著抑制LPS诱导RAW264.7和BV-2两种细胞中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的过量分泌,且具有明显的剂量依赖性。(2)筛选了蜜环菌中的抗炎活性组分并探索了其对神经性炎症的作用机制。采用硅胶柱色谱法对蜜环菌的EtOAc萃取物进行了分离,利用LPS诱导的两种体外炎症模型对分离组分(Fr.1-Fr.6以及剩余相)进行抗炎活性评价,结果发现所有组分在浓度0-100μg/m L范围内对细胞增殖均无影响,其中Fr.2组分对LPS诱导的RAW264.7和BV-2两种细胞中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的过量分泌具有显著的抑制效果。论文进一步研究了Fr.2组分抗神经性炎症的作用机制,免疫印迹实验发现Fr.2组分能显著抑制LPS诱导的BV-2细胞内NF-κB信号通路中p65蛋白的磷酸化,免疫荧光实验证明Fr.2组分通过抑制NF-κB/p65蛋白入核,从而抑制炎症反应的发生。(3)分离并鉴定了蜜环菌中具有抗炎活性的化合物。采用高效液相法对Fr.2中的化合物进行分离纯化,并利用质谱、核磁等方法对化合物进行结构鉴定。从Fr.2中共分离得到7种化合物:5-羟甲基-2-呋喃甲醛、2-呋喃甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、大豆黄素和金雀异黄酮,其中化合物5-羟甲基-2-呋喃甲醛、香草酸和丁香酸在蜜环菌中均为首次发现。抗炎活性实验显示大豆黄素和金雀异黄酮在浓度0-100μM范围内均能剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7和BV-2细胞中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的过量分泌,为蜜环菌中的主要抗炎活性化合物。
