神经酰胺(ceramides)是一种脂类二级信使,广泛参与了细胞的增殖、分化、细胞周期抑制、衰老和细胞凋亡,在医药、食品和化妆品方面具有极大的市场潜力和附加值。由于魔芋飞粉中神经酰胺与磷酸胆碱以鞘磷脂形式结合存在于细胞膜中,从中直接提取神经酰胺得率低,严重影响了魔芋神经酰胺产业化开发的进程,而通过磷脂酶C酶解魔芋鞘磷脂,体外制备神经酰胺的是解决这一问题的有效途径之一。为解决神经酰胺体外生物制备中的技术瓶颈,本文从神经酰胺制备所需磷脂酶C的酶源入手,利用微生物繁殖快、易培养、酶产量高的特点,对产磷脂酶C筛选及初步鉴定,并在此基础上对其产酶条件、所产磷脂酶C的分离纯化及部分酶学性质进行了研究,从而为今后将磷脂酶C开发魔芋神经酰胺类物质打下坚实基础。
主要研究结果如下：
1.产磷脂酶C菌株筛选及初步鉴定
采用卵黄平板法初筛,卵黄杯碟法、生物量及NPPC法复筛,分离得到一株产磷脂酶C菌株Z-13；通过菌株的个体形态学特征和群体形态学特征、生理生化特性,初步鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus Z-13)。
2.产磷脂酶C菌株B. cereus Z-13产酶条件优化
以生物量和磷脂酶C酶活为主要指标,采用单因素优化方法结合均匀设计试验,对B. cereus Z-13产磷脂酶C (phospholipase C,PLC)条件进行了优化,结果表明,魔芋飞粉2.5 g/L、黄豆粉30 g/L、K2HP04·3H2O2.8 g/L、Zn2S04-7H2O1.3g/L、接种量1.0%、摇床转速150 r/min、培养温度32℃、初始pH值9.0,在此条件下培养15 h,活菌总数为4.5×109CFU/mL,卵黄琼脂杯碟法测定磷脂酶C产生的沉淀圈(乳白色晕圈)直径可达30mm,液体摇瓶发酵磷脂酶C活力达23.31 U/ml。
3.B. cereus Z-13磷脂酶C分离纯化
采用硫酸铵沉淀及透析、DEAE-52离子交换层析、琼脂糖凝胶6B层析、Sephadex G-75凝胶过滤等方法对B.cereus Z-13分泌磷脂酶C进行分离纯化研究,并利用Native-PAGE和SDS-PAGE对酶纯度及亚基分子量的测定,纯化倍数39.98倍,比活力135.15 U/mg蛋白,酶活回收率为20.93%; Native-PAGE和SDS-PAGE表明纯化后的磷脂酶C由一种亚基组成,分子量约为34 Ku。
4.B.cereus Z-13磷脂酶C部分酶学性质
B.cereus Z-13磷脂酶C最适作用温度为55℃,最适反应pH值为7.5,当温度超越60℃时,酶活性迅速下降,表明该酶是热不稳定的蛋白质,在pH6.0-8.0时,相对酶活力比较稳定,当pH在6.0以下时,磷脂酶C活力急剧下降。Zn+2、Ca+2、Mg+2不同程度的对该酶有激活作用,Mn+2、Cu+2则对酶活有抑制作用。
5.B.cereus Z-13磷脂酶C降解魔芋飞粉鞘磷脂制备神经酰胺
采用双液相反应体系,以魔芋飞粉脂类粗提物为底物,B.cereus Z-13发酵产磷脂酶C,定向水解鞘磷脂产生游离神经酰胺,HPLC-ELSD测定其含量为神经酰胺含量为0.725 mg/ml,比直接提取法提高到2.9%。
