基于《伤寒论》调和气血法研究活血化痰方对高脂血症大鼠心肌I/R损伤的作用及机制

理论研究《伤寒论》创立了融理法方药为一体的六经辨证理论体系,长期以来一直有效地指导中医临床医学辨证论治,被世人誉为“启万世之法程,诚医门之圣书”。“致和平”中医治疗的最终目标,“疏其血气,令其调达,而致和平”是“和法”的内在本质,张仲景拓展了《黄帝内经》“和法”的内涵,奠定了和法理论与实践的基础,后世对其不断发展补充完善,成为现今指导临床谴方用药的重要治则之一。目前,痰瘀互阻型冠心病已经成为临床常见证候,该病发病率在我国呈逐年增长趋势,虽然祖国医学对其防治已经得到医学界的认可,但是安全有效,质量可控,机制清晰的新药尚有些匮乏。研究结果显示《伤寒论》六经辨证体系对阐明“痰瘀互阻型冠心病”的发生、发展以及诊治有着一定的影响,六经气血运行失和、心神心血失调和痰瘀痹阻心脉是痰瘀互阻型冠心病的主要病因病机。痰瘀痹阻是痰瘀互阻型冠心病病机关键,《伤寒论》“调和气血法”作为其重要治疗策略,“调和气血,活血化痰”使“心脏和平”。以《伤寒论》“气血理论”为理论依据,以“调和气血法”为主要治法而组方的活血化痰方为治疗痰瘀互阻型冠心病的经验方。前期临床研究和实验研究显示,本方能够明显改善痰瘀互阻型冠心病患者临床症状,同时降低患者血脂水平。此外,线粒体DNA突变是导致心血管疾病的致病基础,对冠心病的发生、发展有着重要的影响,经研究气与线粒体在来源、形态、功能、临床症状以及诊疗上具有一定相似之处,气的物质属性可能是线粒体。为此,本课题紧紧围绕“脂质代谢”,“保护靶器官”和“线粒体”这三大目标进行研究,旨在探讨中药对痰瘀互阻型冠心病的防治作用和机制,为研发痰瘀互阻型冠心病的新药提供数据支撑,也为气的物质属性为线粒体的这一科学假说的深入研究提供可参数据。实验研究本课题主要研究基于《伤寒论》“调和气血法”组方的活血化痰方对高脂血症大鼠心肌缺血再灌注损伤的防治作用与机制,同时探讨痰瘀痹阻心脉的实质,也为气的物质属性为线粒体的深入研究提供数据支撑。目的方法1.活血化痰方对高脂血症大鼠脂质代谢动态的影响。采用高脂饲料喂养Wistar大鼠4周,待高脂血症大鼠模型成立后,进行灌胃给药,持续8周,分别在给药4周、6周和8周后,目内眦取血,离心,运用生化法检测血清CHO、TG、LDL-C、HDL-C、FFA等生化指标的水平。2.活血化痰方防治高脂血症大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用研究。采用高脂血症大鼠叠加心肌缺血再灌注模型,缺血40min,复灌2h,分别在给药4周、8周运用生化法检测CK-MB、LDH;再灌注24h后Evans Blue-TTC双染检测心肌梗死面积。采用光镜、电镜技术观察给药8周复灌20min心肌组织形态学。3.活血化痰方防治高脂血症大鼠心肌缺血再灌注损伤机制研究。给药8周,采用高脂血症大鼠叠加心肌缺血再灌注模型,缺血40min,复灌2h。采用生化法和分光光度法检测心肌组织ROS、SDH、COX和血清MDA、T-SOD、Cu Zn-SOD和GSH-PX酶水平,采用实时荧光定量PCR分析法和Western blotting法,分析心肌线粒体生物合成PGC-1α-NRF1-mt TFA通路,心肌脂肪酸氧化PGC-1α-PPARα通路的m RNA转录和蛋白表达水平,以及mt DNA拷贝数。结果1.活血化痰方对脂质代谢的影响。同正常对照组比较,高脂血症模型组大鼠血清CHO、TG、LDL-C在饲养4周、8周、10周、12周生化指标均显著增高。同高脂血症模型组比较,活血化痰方高剂量、中剂量组呈量效、时效相关性不同程度降低高脂血症模型大鼠血清CHO、TG、LDL-C水平,其中活血化痰方高剂量则在给药4周、6周和8周时均显著降低高脂血症大鼠血脂(P<0.05或P<0.01)。经计算AI值和非HDL-C值,活血化痰方各剂量组均低于高脂血症模型组,高剂量和中剂量组优于阳性对照药。2.活血化痰方防治高脂血症大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用研究。同正常对照组比较,高脂血症模型组饲养8周其心肌缺血再灌注2h后CK-MB,LDH无明显区别,饲养12周CK-MB,LDH水平有增高趋势;再灌注24h后,同正常对照组比较,高脂血症模型组心肌梗死面积分别在8周,12周增多。同高脂血症模型组比较,给药4周后,活血化痰方中剂量能够降低心肌缺血再灌注2h LDH水平(P<0.05),降低复灌24h心肌梗死面积。给药8周后降低CK-MB,显著降低心肌梗死面积(P<0.01)。光镜和电镜检测结果显示高脂血症模型组心肌细胞可见明显坏死灶,心肌细胞肿胀,炎性粒细胞浸润,脂滴明显,心肌线粒体肿胀,线粒体嵴紊乱。活血化痰方能够保护心肌细胞,减轻肿胀,炎性细胞浸润,减少心脏脂滴,保护心肌线粒体,可见形态结构完整,线粒体嵴增多,基质密集等。3.活血化痰方防治高脂血症大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究。同正常对照组比较,高脂血症模型组心肌缺血2h后MDA水平显著升高,T-SOD、Cu Zn–SOD、GSP-PX、SDH水平不同程度下降,COX和ROS值无显著变化。活血化痰方显著增加高脂血症大鼠T–SOD,增加Cu Zn–SOD、GSP-PX、SDH,降低MDA水平。显著促进高脂血症大鼠心肌缺血再灌注2h后心肌线粒体PGC-1α-NRF1-mt TFA通路、心肌脂肪酸氧化PGC-1α-PPARα通路m RNA转录和蛋白表达水平,显著促进mt DNA的拷贝数。结论1.《伤寒论》六经辨证体系,治法“调和气血法”对阐明痰瘀互阻型冠心病的病因病机,病势进退,临床诊治,立法谴方有着重要的指导作用,基于该法则下组方的活血化痰方能够起到“调和气血”使“心脏和平”的作用。2.本研究结果从脂质代谢、心肌酶谱、心肌组织形态学以及线粒体生物合成等方面综合分析,高脂血症加重Wistar大鼠心肌缺血再灌注损伤,也客观显示了痰瘀痹阻心脉的实质。3.基于《伤寒论》“调和气血法”组方的活血化痰方,可能通过降低血脂,影响脂肪酸β氧化PGC-1α—PPARα通路,进而影响能量代谢。通过抗氧化应激,促进线粒体生物合成通路PGC-1α-NRF1-mt TFA,促进mt DNA合成,两条通路以PGC-1α为交点共同防御心肌缺血-再灌注损伤。4.以《伤寒论》“调和气血法”为治法组方的活血化痰方通过调和气血,活血化痰安神的功效,对保护高脂血症大鼠心肌缺血再灌注心肌线粒体形态,功能,和促进线粒体生物合成和脂肪酸β氧化相关基因的表达具有一定的影响,这为客观证实气的物质属性为线粒体提供可参数据。5.实验结果客观显示了中医理论对痰瘀互阻型冠心病辨证论治立法处方的指导作用,同时提示西医辨病与中医辨证的合理结合,不仅仅体现在临床诊治层面,更需要在细胞、分子层面合理结合,才能更好地促进现代医学的发展。