清肝凉血解毒方临床疗效观察及对小鼠银屑病样模型的干预作用

银屑病一种以T细胞激活为主的免疫性、炎症性疾病,树突状细胞(DCs)在其免疫学发病机制中具有重要作用。T细胞的激活是以DCs的激活为先导,DCs分泌的炎性细胞因子IL-11β、IL-12、IL-23等在银屑病的发病过程中起着重要的促炎作用。银屑病亦是典型的身心疾病,心理因素在该病的发生、发展及预后中起着重要作用;P物质(SP)、神经肽Y(NPY)、降钙素基因相关肽(CGRP)等作为神经免疫通道中的介质参与银屑病的发病。身心疾病属中医情志疾病范畴,基于银屑病的身心疾病属性,本课题以“从肝论治银屑病”为理论指导,设计1个临床研究和2个动物实验研究,观察清肝凉血解毒方对银屑病血热证患者的治疗效果。根据初步的临床观察结果,进行基础实验以研究清肝凉血解毒方可能的作用机制及靶点,为从肝论治银屑病提供科学依据。一、临床研究目的:观察清肝凉血解毒方对血热型银屑病患者的临床疗效、焦虑情况及中医证候的影响。方法:纳入30例寻常型银屑病血热证患者,给予口服清肝凉血解毒颗粒剂,1剂/日,1天2次,疗程4周。运用银屑病面积及疾病严重程度指数评分(PASI评分)、汉密尔顿焦虑量表评分、瘙痒程度评分、中医证候积分等作为评价标准。结果:纳入的30例患者中,临床痊愈3例(PASI评分达PASI90),显效3例(PASI评分达PASI75),有效17例(PASI评分达PASI50),无效7例(PASI评分小于PASI50),总有效率为76.67%;治疗前后患者PASI评分、汉密顿焦虑量表评分、瘙痒程度评分及中医证候积分的变化均具有统计学差异(P<0.05);治疗前无焦虑患者1例(占3.33%),可能焦虑的为10例(占33.33%),轻度焦虑患者12例(占40.00%),中度焦虑患者5例(占16.67%),重度焦虑患者2例(占6.67%);治疗结束后无焦虑患者17例(占56.67%),可能焦虑的患者11例(占36.67%),轻度焦虑患者1例(占3.33%),中度焦虑患者1例(占3.33%),无重度焦虑患者。治疗后的PASI评分与汉密顿焦虑量表评分之间存在正相关关系,治疗前后PASI评分下降值与汉密顿焦虑量表评分下降值之间也存在正相关关系。结论:清肝凉血解毒方对银屑病血热证具有一定的治疗效果,能改善患者的焦虑情况及中医证候,但由于本次研究样本量较小,上述结论还需要今后大样本研究的验证。二、基础实验一清肝凉血解毒方和凉血活血方对咪喹莫特诱导银屑病样小鼠行为学及神经肽Y表达的影响目的:观察清肝凉血解毒方(QGLXJD)、凉血活血方(LXHX)对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠行为学及神经肽Y(NPY)表达的影响。方法:30只BALB/c雄性小鼠,剔除背部毛发,随机分为空白对照组(C)、模型组(M)、清肝凉血解毒方组(QG)、凉血活血方组(LX)和甲氨蝶呤组(MTX)。背部涂抹5%咪喹莫特乳膏(IMQ)诱导皮肤银屑病样模型。采用银屑病皮损面积和疾病严重程度(Psoriasis area and severity index,PASI)每日进行评分,分别运用旷场及高架十字迷宫评价各组小鼠行为学差异,HE染色后光镜下测量表皮厚度;免疫组化法检测皮损中T淋巴细胞表面标志CD3及表皮中增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况;采用实时PCR技术检测皮损中IL-23、IL-1β、IL-12mRNA表达水平;Western blot法检测皮损中NPY蛋白表达情况。结果:与C组相比,M组表皮厚度、PCNA、CD3+T细胞、IL-1β、IL-12、IL-23mRNA表达均增加(P<0.05);其余组与M组相比,表皮薄,PCNA、CD3+T细胞、IL-1β、IL-12、IL-23mRNA表达水平均降低(P<0.05)。与C组比较,银屑病样小鼠焦虑水平高,以M组最为明显;QG组与M组比较,焦虑水平低,而LX组与QG组比较,焦虑水平高;NPY在M组中表达最多,在LX、QG、C组表达依次减少。相关性分析显示:小鼠在旷场四边及中央区的次数、进入旷场中央区的时间及路程、四边路程与小鼠皮损PASI评分之间均存在负相关关系;小鼠皮损PASI评分与其进入旷场四角的时间、路程之间不存在相关关系,与进入四边的时间呈现正相关关系;小鼠皮损PASI评分与进入闭臂的时间、次数呈正相关关系、与进入开臂的时间、次数呈现负相关关系。结论:清肝凉血解毒方的整体疗效优于凉血活血方,并且其可能是以调控NPY的表达为物质基础,改善小鼠的焦虑行为,从而提升对小鼠银屑病样模型的综合治疗作用。三、基础实验二清肝凉血解毒方对咪喹莫特诱导银屑病小鼠皮损的干预作用目的:观察清肝凉血解毒汤对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮损的影响。方法:72只BALB/c雄性小鼠,背部刮毛,随机分为空白对照组(Control,C)、模型组(Model,M)、复方高、中、低剂量组(Q-H、Q-M、Q-L)和甲氨蝶呤组(MTX),5%咪喹莫特乳膏(IMQ)背部涂抹诱导皮肤银屑病样模型。采用银屑病皮损面积和疾病严重程度(Psoriasis area and severity index,PASI)每日进行评分,光镜下观察皮损组织形态学变化及表皮厚度;免疫荧光法检测皮损中CD11c+树突状细胞、降钙素基因相关肽(CGRP)、NK-1R表达情况;Western blot法检测皮损中P物质(SP)、NPY蛋白表达情况。结果:M组小鼠皮损上鳞屑厚,浸润明显,红斑重;其余各组皮损均较M组轻。与C组相比,M组表皮厚度、PCNA、CD3+T细胞及CD11c+细胞均明显增多(P<0.01);复方各剂量组与M组相比,表皮薄,CD11c+细胞表达个数均明显减少。M组与C组相比,CGRP、NK-1R表达均上调(P<0.05),而余组与M组相比,上述指标的表达均明显下调(P<0.05)。与C组相比,M、MTX、Q-M、Q-L组皮损中SP的表达均呈增高趋势,但组间相比无统计学差异。与C组相比,M组NPY表达量明显增多,两组比较具有统计学差异(P<0.05);MTX组、Q-M组、Q-L组与M组相比,NPY蛋白表达量均较低,各组与M组相比,差异具有统计学意义。相关性分析显示:CD11c+DCs、CGRP、NK-1R、NPY的表达量均与PASI评分呈正相关关系。结论:清肝凉血解毒汤可通过下调NK-1R、CGRP、NPY的表达水平改善小鼠银屑病样皮损,降低表皮细胞的异常增殖、减少皮肤中CD11c+树突状细胞数量,从而有效改善小鼠银屑病样皮损。