新型福寿螺纤维素酶在甲醇毕赤酵母中的表达

植物纤维素是自然界中年产量最大的可再生能源,地球上每年光合作用生成的上亿吨生物质中,纤维素占了近一半。但是,目前自然界中的纤维素只有一小部分得到了利用。因此有效地利用这一可再生资源将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于解决人类社会的环境污染和日益严峻的能源危机有着重大的现实意义。与酸碱处理等化学方法以及蒸爆处理等物理方法相比较,利用纤维素酶来催化水解木质纤维素具有反应条件温和、无副产物和污染少等优点,但生物质存在水解速度慢,降解不完全等缺点,同时由于纤维素结构的复杂性,需要高效多功能纤维素酶的协同作用。 福寿螺是一类对水稻种植造成灾害的入侵生物,已有报道从其胃肠道组织中分离纯化出多种纤维素酶,而相关基因的解析及克隆表达研究尚未取得很好突破,本研究以此为出发点,希望通过对福寿螺的纤维素酶基因的解析和克隆,及在真核系统的表达,进一步揭示福寿螺纤维素酶的真面目。 本研究首先通过RT-PCR的方法从福寿螺胃中扩增出新的纤维素酶cDNA序列―Dy1300,并与克隆载体pMD 18-T相连接,通过对其全序列的分析,确定其开放阅读框ORF长度为882bp,命名为SXYN（GenBank, AY941794）,推定的氨基酸序列含294个氨基酸,与已报道的福寿螺纤维素酶C端基因的同源性达89.8%。对该基因的分析表明,推定的氨基酸序列含有糖苷水解酶的活性位点及糖苷水解酶第10家族特征保守序列,但不含有明显的纤维素结合域。对该酶糖基化位点的分析表明,它具有三个潜在的O-糖基化修饰位点。由此推测所获得的新基因可能为多种福寿螺纤维素酶中的一个,为此,进一步将基因导入真核生物,研究其表达效果和纤维素酶活。 通过PCR将目的基因cDNA两端分别加上EcoR I和Not I酶切位点,插入到经过酶切处理的表达质粒pPIC9K的多克隆位点中,构建重组表达质粒pPIC9K-SXYN。利用电转化方法,将重组质粒线性化后转化入酵母宿主GS115中;对在MD平板上生长出单菌落进行G418抗性筛选,以获得高拷贝的阳性克隆,并进一步对获取的阳性克隆进行PCR验证,进行重组子的Mut+和MutS表型鉴定;