阿胶补肾健骨方治疗大鼠骨质疏松症的作用机制研究

目的： 通过理论研究认识骨质疏松症（Osteoporosis，OP），运用中西医不同的治疗方法，观察去卵巢大鼠骨质疏松症模型的一般情况，骨病理学特征，骨密度（bone mineral density，BMD），骨生物力学，骨代谢的血生化指标以及维生素D受体（Vitamin D receptor，VDR）的基因表达等变化，探讨阿胶补肾健骨方对骨质疏松症的影响及作用机制，为运用中医药治疗骨质疏松症提供科学依据。 方法： 采用8月龄雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠建造骨质疏松症模型，共70只。实验前置动物于室内适应环境一周，室温18-22℃。将大鼠随机分为以下4组：假手术组（17只）、模型组（17只）、阿胶补肾健骨方组（18只）、阿仑膦酸钠（alendronate sodium）组（18只）。假手术组正常饲养；模型组给予生理盐水灌胃90天，其他各组动物灌胃治疗90天，停止治疗1天，备用。 观察活体大鼠一般表现情况，体重变化。观察治疗三个月后，各组动物经腹腔麻醉，股动脉取血备用。记录双肾重量、右侧股骨重量及子宫重量。将其右侧股骨上的软组织剥离、剔净，用LUNAR-Prodigy双能X线BMD仪测定大鼠全股骨及股骨两端BMD，然后置于生物力学测定仪上测定最大载荷（maximum load，ML）和刚度（stiffness）。取其左侧股骨置于中性福尔马林溶液中固定，常规苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色，按要求制备病理片，显微镜下观察骨组织（bone tissue）结构变化。采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）对大鼠血清骨钙素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型前胶原羧基端前肽（procollagen I carboxyterminal propeptide，PICP）、25羟基维生素D3(25-hydroxyvitamin D3，25（OH）D3)、1,25二羟基维生素D3(1,25-dihydroxyvitamin D3，1,25（OH）2D3)测定研究。用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）测定肾脏VDR的基因表达。 统计学处理：采用SPSS15.0统计软件包对各项检测数据进行方差分析，所有数据结果均以均数加减标准差（x±s）表示，以P＜0.05为差异，具有统计学意义。 结果： 1大鼠一般表现情况：与假手术组大鼠相比，模型组大鼠精神相对萎靡呆滞或见有狂躁不安，反应较迟钝，毛发无光泽而凌乱，少动嗜睡；阿胶补肾健骨方组、阿仑膦酸钠组大鼠在给药治疗过程中，情绪较稳定，精神状态较佳、较活跃，反应较敏捷，毛发顺整。 2大鼠体重变化：与假手术组大鼠相比，模型组于造模后两个月起，体重明显高于假手术组；阿胶补肾健骨方组体重渐增，与假手术组相近，具有统计学意义；阿仑膦酸钠组体重增加较为明显。 3大鼠子宫指数：与假手术组大鼠相比，各组均明显降低，P＜0.05；阿胶补肾健骨方组、阿仑膦酸钠组与模型组大鼠相比较，均有明显提高，其中阿胶补肾健骨方组明显优于阿仑膦酸钠组，有统计学意义。 4大鼠双肾指数：与假手术组大鼠相比，模型组大鼠双肾指数明显减轻，P＜0.05；阿胶补肾健骨方组、阿仑膦酸钠组与模型组大鼠相比较，双肾指数均有提高，其中阿胶补肾健骨方组明显优于阿仑膦酸钠组，有统计学意义。 5大鼠股骨重量：与假手术组大鼠相比，各组均明显降低，P＜0.05；阿胶补肾健骨方组、阿仑膦酸钠组与模型组大鼠相比较，均有明显提高，其中阿胶补肾健骨方组明显优于阿仑膦酸钠组，有统计学意义。 6骨组织病理学切片观察：与假手术组大鼠相比，模型组大鼠骨松质部位骨小梁明显减少，排列稀疏、不整齐，部分断裂；阿胶补肾健骨方组、阿仑膦酸钠组与模型组大鼠相比较，骨小梁数量减少不明显，排列较规则，连续性、完整性较好；两组与模型组比较，骨形态学结构变化具有统计学意义。 7BMD变化：与假手术组大鼠相比，模型组大鼠的股骨BMD明显偏低，经统计学分析，差异显著（P＜0.05）；给药治疗三个月后，各给药组大鼠的股骨BMD均有明显提高，与模型组比较，P＜0.05；阿胶补肾健骨方组与阿仑膦酸钠组相比较，BMD变化不明显，升高幅度接近，差异无统计学意义。 8骨生物力学测定：与假手术组大鼠相比，模型组大鼠股骨的最大载荷、刚度都明显降低，P＜0.05；阿胶补肾健骨方组、阿仑膦酸钠组与模型组大鼠相比较，大鼠股骨的最大载荷、刚度均明显增高，其中阿胶补肾健骨方组优于阿仑膦酸钠组，有统计学意义。 9大鼠血清OCN、PICP水平变化：与假手术组大鼠相比，模型组大鼠血清OCN、PICP水平都明显降低，P＜0.05；阿胶补肾健骨方组、阿仑膦酸钠组与模型组大鼠相比较，大鼠血清OCN、PICP水平均明显增高，P＜0.05；阿仑膦酸钠组对大鼠血清OCN的影响略优于阿胶补肾健骨方组，阿胶补肾健骨方组对大鼠血清PICP的影响优于阿仑膦酸钠组，有统计学意义。 10大鼠血清25（OH）D3、1,25（OH）2D3水平：与假手术组大鼠相比，模型组大鼠血清25（OH）D3、1,25（OH）2D3都明显降低，P＜0.05；阿胶补肾健骨方组、阿仑膦酸钠组与模型组大鼠相比较，大鼠血清25（OH）D3、1,25（OH）2D3水平均明显增高，P＜0.05；阿胶补肾健骨方组对大鼠血清25（OH）D3、1,25（OH）2D3水平的影响优于阿仑膦酸钠组，具有统计学意义。 11大鼠肾脏VDR-mRNA的基因表达：与假手术组大鼠相比，模型组大鼠VDR的基因表达水平有显著性差异（P＜0.05）；给药治疗三个月后，各给药组大鼠VDR的基因表达水平均有明显提高，与模型组比较，P＜0.05；阿胶补肾健骨方组对大鼠VDR的基因表达水平优于阿仑膦酸钠组，差异有统计学意义。 结论： 1大鼠去卵巢术建造骨质疏松症模型复制成功。 2实验表明：阿胶补肾健骨方可以改善骨质疏松症大鼠一般表现情况；阿胶补肾健骨方有类似雌激素样作用，调节脂代谢，不致于使其体重迅速增加；阿胶补肾健骨方可以增加子宫指数、双肾指数、股骨重量；阿胶补肾健骨方能延缓骨量丢失，提高BMD，改善骨超微结构和骨强度；阿胶补肾健骨方能增加去卵巢大鼠血清中OCN、PICP、25（OH）D3、1,25（OH）2D3的浓度，同时上调肾中VDR的基因表达水平。说明阿胶补肾健骨方对大鼠骨质疏松症有较好的预防和治疗作用，其作用机制体现多靶点、多途径、多环节促进骨钙磷的代谢，促进骨形成和骨重建，抑制破骨细胞（osteoclast，OC）增殖、骨细胞（osteocyte）和成骨细胞（osteoblast，OB）凋亡。