疼痛(Pain)是一种生理和心理复合型的临床症状,也是临床疾病发生过程中最为常见的症状之一,疼痛严重影响患者原发疾病的治疗和生活质量。疼痛的发生对患者的身心健康产生严重的不良影响。国际疼痛协会将疼痛定义为是一种以组织损伤或潜在组织损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验,其包含了患者的感觉、情感也包含了患者的动机、认知评价等方面。能够引发以疼痛为主要表现的疾病病因广泛存在,并且可涉及大多数的组织器官,所以疼痛对健康的影响范围极其广泛。世界卫生组织更是将疼痛列为继呼吸、血压、体温和脉搏之后的第五大生命体征。由于以上原因,医药工作者对于疼痛的机制以及诊治的研究,包括治疗疼痛的药物研发、疼痛神经生理学机制的探究、疼痛发生的心理因素、疼痛性质转变原因等等,一直备受关注。其中疼痛的病理生理机制研究尤为重要,其对临床用药和新药开发具有指导意义,也是最终解决临床上疼痛治疗问题的关键所在。随着对疼痛机制研究的不断深入,大量与疼痛相关的重要分子、受体蛋白和离子通道被发现,如环氧合酶(cyclo-oxygen-ase, COX)、非选择性阳离子通道瞬时感受器电位通道(transient receptor potential, TRP)家族、吗啡受体、Mas基因相关G蛋白藕联受体(Mas-related G protein-coupled receptors, Mrgprs)等。其中COX2为非甾体类解热镇痛药的治疗靶点,是临床重要的疼痛治疗药物；瞬时电压门控阳离子通道V1 (Transient receptor potential cation channel V1, TRPV1)与热痛和化学刺激性疼痛的发生关系密切。虽然近年来,对于疼痛机制的研究不乏重要发现,但由于不同的致病因素、发病部位和疾病导致的疼痛特点截然不同,其中发挥重要作用的分子亦不相同,所以为了更全面的了解疼痛的发生机制以及更好解决临床疼痛问题,发现和探索不同疼痛疾病中共同的重要分子以及某种疼痛中所特有的重要分子,具有重要的研究价值和现实意义。胰岛细胞自身抗原蛋白69(Islet cell antigen protein 69, ICA69)是由480个氨基酸组成的,分子量为69kD的蛋白质,最早被发现在Ⅰ型糖尿病患者的胰岛细胞中,故而得名。近年来,其被发现在多种引发疼痛的疾病中表达增高,如糖尿病并发的神经病理性疼痛、类风湿性关节炎和原发性干燥综合症中均呈现显著性的表达增高,并且其表达水平与病情和疼痛程度存在相关性。ICA69与相关疾病的研究报道较为多见,但其与疼痛的关系鲜有报道,基于以上原因本文通过一系列实验研究探讨其在疼痛中的作用及机制,为疼痛的病理生理研究提供相关的基础研究数据。中医中药在几千年治疗疾病的实践中,积累了大量治疗疼痛的方法和经验,对临床解决疼痛问题提供了更为多样的有效治疗方法,包括针灸、推拿、刮痧和汤药等等。其中汤药的应用在现代中医临床应用较为广发,因为其具有疗效确切、个体化治疗、不良反应少等优点。葛根芩连汤方出自《伤寒论》34条,由葛根、黄芩、黄连、炙甘草组成,方中葛根为君药,辛甘化凉,入脾胃经,既能升阳脾胃清阳之气而治下刹,又能解表退热；黄芩、黄连为臣药,可清热燥湿、厚肠止利；甘草为佐使药,可调和诸药；全方共奏清热燥湿,生津润燥之功。临床和基础研究均显示该方剂对糖尿病的治疗有效,能够显著改善糖尿病的各项原发症状。因为ICA69与糖尿病的发生密切相关,而糖尿病发病后常见的并发症状就包含了持续顽固的自发疼痛和通觉过敏,所以观察葛根芩连汤对糖尿病疼痛的影响以及基于ICA69探讨其作用机理,为该方剂阐明治疗糖尿病的药理学机制,成为本研究的又一重要内容。实验目的观察胰岛细胞自身抗原蛋白69(Islet cell antigen protein 69, ICA69)表达的改变对实验动物热痛、机械痛和炎症性疼痛行为的影响,以此判断ICA69在不同疼痛模型中的作用,即ICA69与疼痛类型之间的关系,并探讨其相关机制。预实验结果显示,ICA69可以显著炎症性疼痛动物行为学,所以进一步期望从ICA69缺失与神经系统功能和ICA69缺失与炎症发生关系两个角度,探讨研究ICA69影响炎症性疼痛的具体机制,为疼痛的诊治提供基础研究的依据,为进一步研发疼痛治疗药物与疼痛治疗方法拓展思路。观察葛根芩连汤对糖尿病疼痛的治疗作用,并基于ICA69进一步进行机制研究。实验方法(1)统计分析野生型小鼠和ICA69-/-小鼠在甩尾实验、Von Frey机械刺激实验、甲醛皮下注射炎症痛实验中行为学结果,并进行比较,观察ICA69缺失后对3种疼痛行为的影响。(2)应用逆转录PCR技术检测神经系统中ICA69的表达情况,并通过免疫组织荧光染色(Immunofluorescence staining,IF)得到背根神经节(Dorsal root ganglia, DRG)中ICA69阳性神经元的分子特性,并比较与炎症性相关的重要分子,包括非选择性阳离子通道瞬时感受器电位通道V1、 A1 (Transient receptor potential cation channel V1、A1, TRPV1、TRPA1)和降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide, CGRP)在ICA69缺失后,生理状况下的表达情况。(3)应用蛋白免疫印迹方法(Western blot, WB)检测炎症模型动物中ICA69本身在炎症局部和背根神经节神经元的表达水平。应用免疫荧光染色比较野生型小鼠和ICA69-/-小鼠在病理状态下炎症性疼痛相关分子的表达情况。(4)提取野生型小鼠和ICA69-/-小鼠炎症局部皮肤释放物,以此作为刺激物分别对野生型小鼠和ICA69-/-小鼠的原代DRG神经元进行钙离子成像研究,判断ICA69参与炎症性疼痛干预的机制。(5)根据上述实验结果,探讨ICA69在炎症发生过程中的作用及机制。制备甲醛炎症疼痛模型后,观察野生型小鼠和ICA69-/-小鼠局部肿胀情况,以及局部形态学变化。应用逆转录PCR检测重要的炎症细胞(巨噬细胞、肥大细胞)中ICA69是否表达,同时检测炎症局部释放物中肿瘤坏死因子-a (Tumor Necrosis Factor α, TNF-α)、白细胞介素-1p(Interleukin-1β, IL-1β)和白细胞介素-6 (Interleukin-6, IL-6)等细胞因子的表达水平。最后通过甲醛刺激原代巨噬细胞实验检测ICA69缺失对核转录因子NF-κB激活的影响。(6)通过腹腔单次大剂量注射链脲佐菌素(STZ)制备小鼠糖尿病疼痛模型,模型制备后给予葛根芩连汤水煎液灌胃,观察该方剂对模型小鼠血糖、体重、疼痛行为的影响,并进一步检测其对小鼠胰腺组织ICA69表达水平和血清炎症因子水平。实验结果(1)ICA69的缺失能够显著减少实验动物在甲醛所导致的炎症性疼痛中的疼痛行为(P<0.01),但对实验动物的热痛行为学和机械痛行为学未见显著影响。(2)ICA69在外周神经系统中存在表达,其阳性神经元多为小直径的肽能无髓鞘神经元,ICA69的缺失对瞬时电压门控阳离子通道V1 (Transient receptor potential cation channel V1, TRPV1)、瞬时电压门控阳离子通道A1 (Transient receptor potential cation channel Al, TRPA1)和降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related peptide, CGRP)等在炎症性疼痛中扮演重要角色的分子表达无显著影响。(3)甲醛致痛的模型组小鼠炎症局部和DRG中ICA69的表达水平与对照组比较无显著性差异(P>0.05),同时ICA69-/-小鼠进行造模处理后,TRPV1、 TRPA1和CGRP等分子的表达情况与野生型模型鼠比较亦无显著性差异(P>0.05)。(4)钙离子成像结果显示：野生型小鼠和ICA69-/-小鼠DRG神经元对相同的刺激物的反应无显著性差异(P>0.05),而野生型模型小鼠炎症皮肤释放物所引起的神经元细胞反应比例显著高于ICA694-/-模型小鼠(P<0.05),提示两种皮肤释放物的组成存在显著差异,ICA69可能参与了炎症的发生过程而对神经系统功能的影响不明显。(5)肿胀度检测实验和病理学染色实验均提示ICA69缺失后造模,实验动物炎症局部肿胀程度显著降低(P<0.05)；逆转录PCR结果显示在巨噬细胞和肥大细胞中均存在ICA69的表达；ELISA检测野生型模型鼠和ICA69-/-模型小鼠炎症局部皮肤释放物中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平,结果显示前两者在ICA69-/-模型小鼠炎症局部皮肤释放物中显著低表达(P<0.05)；原代细胞培养巨噬细胞,进行核转录因子NF-κB激活检测实验,结果显示ICA69缺失后,在甲醛和脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的刺激下,与野生型小鼠巨噬细胞比较,ICA69-/-原代巨噬细胞核转录因子NF-κB的激活程度显著降低(P<0.05)。(6)葛根芩连汤能够显著逆转由于STZ造模所引起的动物体重、血糖的改变,同时模型小鼠对热刺激(P<0.01)、机械刺激(P<0.01)、冷刺激(P<0.05)的痛阂降低也可以被葛根芩连汤逆转。葛根芩连汤能够显著降低造模引起的胰腺组织ICA69表达增高,同时模型小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-1β也通过给予葛根芩连汤被显著降低。实验结论(1)ICA69在外周神经系统和免疫细胞中存在表达；(2)ICA69参与了甲醛所致的炎症性疼痛；(3)ICA69敲除后可以减弱核转录因子NF-κB的激活,抑制炎症早期重要细胞因子TNF-α、IL-1β的生成,降低炎症程度从而使炎症性疼痛减轻。(4)葛根芩连汤能够有效改善糖尿病疼痛模型小鼠的疼痛行为变化,其机制可能通过降低ICA69的表达从而减弱慢性炎症发挥作用。
