转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一类通过TGF-β/Smads通路来发挥其生物学效应的家族,此因子尤其在肿瘤的发生发展的过程中具有重要作用。在TGF-β/Smads通路中的任何一个组件出现异常均有可能造成信号传导通路发生混乱,使得TGF-β失去其应有生物学效应,失去抑制细胞生长的效能,导致肿瘤的发生和发展,但是对于不同种类的肿瘤,TGF-β/Smads中发挥作用的关键基因并不完全相同。流行病学统计表明,宫颈癌在全球妇科恶性肿瘤居于第二位,并且在发展中国家中发病率较高,但是宫颈癌具体发病机制目前依据不是十分清晰。因此,本次研究重点解释宫颈癌发病过程中TGF-β/Smads通路的作用机制,从而为全面说明宫颈癌发病机制提供分子生物学依据。本次研究首先对宫颈癌组织中TGF-β1、TGF-β的两个受体以及Smad2、Smad3、Smad4和Smad7的表达水平作为临床指标;其次,通过对宫颈癌中位于TGF-β1基因启动子区509、800、988以及外显子区869、915和788位,TGFBR2的875位点以及TGFBR1 Int7G24A和*6A位点的基因突变频率分布,探讨基因多态性位点与宫颈癌易感性之间的相关性;最后,根据宫颈癌组织中TGFBR1、TGFBR2和Smad4基因的甲基化状态,进一步分析基因m RNA和蛋白表达水平与甲基化之间的相关性。第一部分:宫颈癌组织中TGF-β/Smads通路中关键基因表达情况目的:研究宫颈癌组织中TGF-β/Smads通路中关键基因表达情况。方法:对宫颈癌组织中TGF-β1、TGFBR1、TGFBR2、Smad2、Smad3、Smad4和Smad7的m RNA表达水平使用半定量RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)法进行测定,并对TGF-β1、TGFBR1、TGFBR2、Smad2/3、Smad4和Smad7蛋白表达水平采用免疫组化方法进行测定。结果:宫颈癌组织中TGFBR1、TGFBR2、Smad2、Smad3和Smad4的m RNA表达水平明显低于正常组织;TGF-β1和Smad7的m RNA表达水平明显高于正常组织;并且TGFBR1、TGFBR2、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达水平也明显低于正常组织;TGF-β1、Smad7蛋白表达水平也明显高于正常组织;其蛋白的表达水平与宫颈癌分期呈一定相关性。结论:宫颈癌的浸润转移可能与TGF-β1和Smad7的过表达有关。宫颈癌中的TGFBR1和TGFBR2、p-Smad2/3和Smad4、TGF-β1和Smad7、TGFBR1和p-Smad2/3之间的蛋白表达呈正相关,TGF-β1和TGFBR1、TGF-β1和p-Smad2/3、TGFBR1和Smad7之间呈负相关,p-Smad2/3和Smad7之间无明显相关性。此结果提示TGF-β受体、R-Smad和Smad4基因任何一个发生变化,均会造成肿瘤细胞失去TGF-β1的敏感性而产生异常增殖。第二部分:TGF-β1及其两种受体多态性与宫颈癌易感性目的:通过病例对照探讨TGF-β1及其两种受体多态性与宫颈癌易感性的相关性。方法:分别使用聚合酶链反应-引物引入限制性内切酶分析(Polymerase chain reaction-primer introduced restriction analysis,PCR-PIRA)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RELP)、PCR产物长度分析、聚合酶链反应-扩增阻滞突变技术(Polymerase chain reaction-amplification refractory mutation system,PCR-ARMS)等方法对基因进行分析,使用ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)方法检测宫颈癌患者及健康对照人群的TGF-β1血浆水平,使用免疫组化与TUNEL双标法对宫颈癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞的凋亡情况进行检测。结果:宫颈癌组TGF-β1基因第509、869位发生突变的几率明显高于健康人群(P<0.01)。宫颈癌患者TGFBR1基因中的Int7G24A位点和*6A位点存在基因多态性,但与TGFBR1的表达无直接相关性。宫颈癌患者TGFBR2基因中的875位点存在基因多态性,但与TGFBR2的表达无直接相关性。结论:基因多态性与宫颈癌发生率之间存在一定的相关性,TGF-β1-509携带有T等位基因发生宫颈癌的风险性较高;TGFBR1基因的Int7G24A位点携带A等位基因患宫颈癌的风险性较高;TGFBR2基因的875位点携带A等位基因患宫颈癌的风险性较低。第三部分宫颈癌中TGF-β两种受体和Smad4基因甲基化状态分析目的:探讨宫颈癌中TGF-β两种受体和Smad4基因甲基化状态及与m RNA蛋白表达的相关性。方法:对宫颈癌组织中TGF-β两种受体和Smad4的甲基化状态使用甲基化特异性聚合酶链式反应方法(Methylation specific polymerase chain reaction,MSP)进行检测,并对其与临床指标相关性进行分析。结果:随着宫颈癌分期的增高TGFBR1基因的表达显著增高。随着宫颈癌分期的增高TGFBR2基因的表达显著增高;分化程度越低,其甲基化程度越高。结论:宫颈癌组织中TGFBR1和TGFBR2甲基化与m RNA和蛋白表达缺失之间存在明显的相关性。对于宫颈癌的预后及其进展状况评鉴,检测TGFBR1、TGFBR2及Smad4三种基因甲基化检查有着积极的意义。
