枳壳化学成分的研究

枳壳（Aurantii Fructus）为芸香科柑橘属植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培变种的干燥未成熟果实。枳壳气清香，味苦、微酸，用于治疗食积不化，脏器下垂等症状，是一种常用的中药材。 枳壳中的化学成分主要由黄酮、生物碱、香豆素及挥发油等类化合物组成。本实验利用柱色谱、制备型高效液相色谱及重结晶等手段对枳壳的80%乙醇提取物中的化学成分进行了分离，共分离出10个单体化合物。利用波谱学手段并结合理化性质，鉴定了它们的化学结构，分别是柠檬苦素（Lm1）、β-谷甾醇（Lm2）、川陈皮素（5,6,7,8,3′,4′-六甲氧基黄酮，Lm3）、诺米林（Lm4）、甜橙素（5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮，Lm5）、柚皮素（5,7,4′-三羟基二氢黄酮，Lm6）、5,7,8,4′-四甲氧基黄酮（Lm7）、3,5,7,8,3′,4′-六甲氧基黄酮（Lm8）、5,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮（Lm9）、胡萝卜苷（Lm10）。其中诺米林（Lm4）、3,5,7,8,3′,4′-六甲氧基黄酮（Lm8）和5,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮（Lm9）首次从枳壳中分离得到。 本实验还建立了枳壳药材中甜橙素（5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮，Lm5）和5,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮（Lm9）的HPLC含量测定方法。 一、枳壳化学成分的提取、分离与结构鉴定 1.提取 取20.0kg干燥的枳壳药材，粉碎，采用加热回流的方式提取，提取溶剂为80%乙醇，提取三次，溶剂用量分别为药材质量的10倍、8倍、8倍（V/W），提取时间分别为1.5h、1.0h、1.0h，合并提取液，过滤，减压浓缩得到粗提取物3.0kg。 2.分离、纯化 将3.0kg粗提取物，用流动相1作为洗脱液进行硅胶柱层析分离，得到A、B、C、D、E、F、G、H共8个部分。 （1）将C1和C6两个部分反复进行硅胶柱层析和ODS柱层析分离，分别得到Lm1和Lm2、Lm4三个单体化合物； （2）将D1、D3和D4三个部分反复进行硅胶柱层析和ODS柱层析分离，分别得到Lm3、Lm5和Lm6三个单体化合物； （3）将D5和D6两个部分分别使用制备型高效液相色谱仪分离，得到Lm7、Lm8和Lm9三个单体化合物； （4）将D7部分重结晶得到单体化合物Lm10。 3.结构鉴定 利用波谱学手段，结合理化性质并查阅相关文献，确定了这10个化合物的化学结构，它们分别是柠檬苦素（Lm1）、β-谷甾醇（Lm2）、川陈皮素（5,6,7,8,3′,4′-六甲氧基黄酮，Lm3）、诺米林（Lm4）、甜橙素（5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮，Lm5）、柚皮素（5,7,4′-三羟基二氢黄酮，Lm6）、5,7,8,4′-四甲氧基黄酮（Lm7）、3,5,7,8,3′,4′-六甲氧基黄酮（Lm8）、5,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮（Lm9）和胡萝卜苷（Lm10）。 二、RP-HPLC法测定枳壳中两种多甲氧基黄酮的含量 1.仪器和色谱条件色谱仪：Agilent1200HPLC，二极管阵列检测器（DAD）；色谱柱：Acchrom Unitary C18Column(4.6×250mm，5μm)；色谱条件：流动相：甲醇-水（体积比52：48）；流速：1.0mL·min-1；柱温：25.0℃；检测波长：310nm；进样量：20μL。 2.方法学考察 2.1线性关系 化合物甜橙素（5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮，Lm5）和5,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮（Lm9）分别在0.011～5.3μg和0.010～5.1μg范围内线性关系良好。线性方程及线性系数r分别为：Lm5：y=53411x+56.071r=0.99995Lm9：y=22869x+21.006r=0.99995 2.2检测限和定量限 由测定结果可知，化合物Lm5和Lm9的检测限分别为1.3×10-3μg和2.7×10-3μg；定量限分别为4.6×10-3μg和1.1×10-2μg。 2.3精密度 由测定结果可知，化合物Lm5和Lm9日内精密度的RSD分别为1.6%和0.58%，均小于2%，说明日内精密度良好； Lm5和Lm9日间精密度的RSD分别为1.1%和1.5%，均小于2%，表明日间精密度良好。 2.4重复性 由测定结果可知，化合物Lm5和Lm9的含量的RSD分别为0.16%和1.5%，均小于2%，表明重复性良好。 2.5稳定性 由测定结果可知，化合物Lm5和Lm9峰面积的RSD分别为0.53%和0.49%，保留时间的RSD分别为0.35%和0.29%，均小于2%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。 2.6加样回收率 化合物Lm5和Lm9的平均回收率分别为101.4%和100.7%，其RSD分别为1.22%和1.51%，均小于2%，表明回收率良好。 3.含量测定 两种枳壳药材中化合物Lm5的平均含量为0.16mg·g-1，Lm9的平均含量为0.024mg·g-1。 4.总结 本论文在国内外学者研究的基础上，对枳壳的化学成分进行了深入的研究，共分离鉴定了10个单体化合物。并建立了枳壳药材中甜橙素（5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮，Lm5）和5,7,8,3′,4′-五甲氧基黄酮（Lm9）的HPLC含量测定方法，为完善枳壳药材的质量标准以及枳壳的开发利用提供了新的科学依据。