类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节肿胀、滑膜炎症和软骨破坏为特征的自身免疫性疾病,具有较高的发病率和致残率,是造成人群劳动力丧失的主要疾病之一。尽管RA的病因及发病机制尚未完全明确,但其主要的病理环节基本清楚,即免疫功能失调、关节滑膜细胞过度增殖与滑膜增厚、关节软骨与骨破坏等三个方面。目前尚缺乏真正有效而副作用小的治疗药物,因此,对RA的发生和发展过程予以系统而合理的解释,并寻找作用显著、副作用小的天然活性成分或其衍生物逐渐成为RA药物的研究热点。
本课题组的前期研究成果和国外相关文献均表明二氢黄酮类化合物——橙皮苷具有一定的抗风湿作用,然而其水溶性较差、生物利用度不高等缺陷限制了其在医药领域的广泛应用,目前国内外有关橙皮苷的结构改造方面有着深入地研究,通过橙皮苷结构修饰后得到的衍生物,其水溶性、吸收性以及其药物疗效都有了一定的改善。在前期工作中,我们针对橙皮苷的结构特征进行了结构修饰,得到了一系列橙皮苷衍生物。本课题正是在前期研究的基础上,对橙皮苷衍生物进行了抗炎活性筛选,并以佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠为对象,观察了具有较高抗炎活性的橙皮苷衍生物(7, 3'-二甲氧基橙皮素)的抗风湿作用,同时从影响AA大鼠免疫功能和滑膜细胞增殖/凋亡角度探讨了其治疗AA的可能作用机制,为将其开发为治疗RA的新药奠定实验基础。本课题的主要研究内容包括以下三个方面:
1、橙皮苷衍生物抗炎活性的筛选研究
目的:通过体内、外实验筛选橙皮苷衍生物抗炎活性。方法:放射免疫法、高效液相色谱法分别检测橙皮苷衍生物对AA大鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage, PMΦ)前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)和白三烯B4 (leukotrieneB4, LTB4)生物合成的影响,采用二甲苯诱导小鼠耳肿胀模型对系列衍生物进行抗炎活性筛选,观察抗炎活性较好的衍生物对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀和AA大鼠继发性炎症的影响。结果:衍生物2(5, 7, 3'-三乙酰橙皮素)和衍生物5(7, 3'-二甲氧基橙皮素,7, 3'-dimethoxy hesperetin,DMHP)体外均显著抑制AA大鼠PMΦPGE2和LTB4的合成,并呈明显的剂量依赖关系;二甲苯诱导小鼠耳肿胀筛选实验结果也表明5, 7, 3'-三乙酰橙皮素和DMHP具有良好的抗炎效果,作用与萘普生相当;进一步研究表明7, 3'-三乙酰橙皮素和DMHP对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀和AA大鼠的继发性炎症具有较好的治疗作用,且等摩尔剂量的DMHP优于母体橙皮苷。结论:通过体内、体外实验筛选得到的橙皮苷衍生物——5, 7, 3'-三乙酰橙皮素和DMHP抗炎活性较强,尤其是DMHP的抗炎作用显著优于橙皮苷,具有进一步研究开发前景。
2、7, 3'-二甲氧基橙皮素对AA大鼠的抗炎免疫作用及部分机制研究
目的:根据AA大鼠的足肿胀度、多发性关节炎指数、体重和病理形态等改变,研究DMHP对大鼠AA的治疗作用;以脾淋巴细胞、腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage, PMΦ)、滑膜细胞等免疫细胞为靶点,探讨DMHP调节AA大鼠异常免疫功能的可能作用机制。方法:足趾皮内注射弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant, FCA)诱导大鼠AA模型;DMHP(22, 44, 88 mg/kg)灌胃给药;足容积法测量足肿胀度;称重法测定体重、胸腺和脾脏重量;HE染色观察踝关节病理组织学变化并进行评分;免疫组化法观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在滑膜组织中的表达;MTT法和放射免疫法分别检测经ConA诱导的脾脏T淋巴细胞增殖反应和IL-2水平;EILSA和RT-PCR法检测经LPS诱导的PMΦ分泌的IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平及基因表达变化;胶原酶-胰酶法分离培养原代滑膜细胞,放射免疫法和EILSA法检测滑膜细胞分泌的PGE2和IL-1、TNF-α水平;并检测DMHP(2, 10, 50, 250μmol/L)体外给药对脾脏T淋巴细胞增殖反应及PMΦ分泌IL-1β、IL-6的影响。结果:DMHP体内给药可减轻AA大鼠原发性和继发性足肿胀,显著降低AA大鼠多发性关节炎指数、缓解AA大鼠体重的下降和下调AA大鼠升高的脏器指数;病理组织学检查和评分结果提示DMHP在抑制AA大鼠滑膜组织增生、减少炎细胞浸润、抑制血管翳形成,减轻骨及软骨破坏等方面均有明显疗效;DMHP能下调AA大鼠关节继发性炎症过程中VEGF在滑膜组织中的表达;DMHP可以明显恢复AA大鼠低下的脾脏T淋巴细胞增殖反应和IL-2产生,并能从转录水平和蛋白表达水平,抑制AA大鼠PMΦ产生过高的IL-1β、IL-6、TNF-α,而增加IL-10的产生;DMHP还可以抑制AA大鼠原代滑膜细胞亢进的分泌功能,降低PGE2和IL-1、TNF-α水平;体外实验结果也表明:DMHP能恢复AA大鼠低下的脾脏T淋巴细胞增殖反应、降低AA大鼠PMΦIL-1β、TNF-α的水平。结论:上述结果表明DMHP对AA大鼠继发性炎症具有明显的改善作用。DMHP通过减少炎症介质的释放、促进抗炎细胞因子的产生,恢复细胞因子的网络平衡。调节AA大鼠异常的免疫功能可能是DMHP对AA大鼠发挥治疗作用的重要途径之一。
3、7, 3'-二甲氧基橙皮素对AA大鼠滑膜细胞凋亡的影响及可能机制研究
目的:观察DMHP体内、体外对AA大鼠滑膜细胞凋亡的影响,并从Bcl-2基因家族、Caspase3、胞质游离钙浓度([Ca2+]i)等角度探讨DMHP诱导滑膜细胞凋亡的作用机制。方法:AA大鼠造模后,DMHP(22, 44, 88 mg/kg)灌胃给药;TUNEL法原位检测滑膜细胞凋亡;免疫组化法检测滑膜组织Bcl-2、Bax的表达;MTT法检测滑膜细胞增殖反应。组织块培养法分离培养大鼠成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS);MTT法检测DMHP体外给药对AA-FLS增殖反应的影响;Hoechst 33342染色、DNA琼脂糖电泳、透射电镜等方法观察DMHP体外给药对AA-FLS凋亡情况;采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;RT-PCR、Western blot法分别检测Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA及Bcl-2、Bax、Caspase3 p20蛋白表达变化;紫外分光光度法检测Caspase3活性;采用钙离子荧光探针(Fluo-3 AM)作为指示剂,活细胞工作站检测胞内钙离子浓度变化。结果:DMHP体内给药能显著抑制AA大鼠滑膜细胞增殖和诱导滑膜细胞凋亡,明显降低AA大鼠滑膜组织中Bcl-2的表达、提高Bax表达,降低Bcl-2/Bax的比值;DMHP体外给药作用于AA-FLS 48 h,DMHP能剂量依赖性地抑制AA-FLS增殖;DMHP处理组AA-FLS呈现出DNA阶梯状条带和典型的凋亡细胞核形态;Annexin-V FITC/PI双染法表明DMHP(50, 250μmol/L)可以显著提高AA-FLS凋亡率;RT-PCR和Western blot结果表明DMHP体外给药能显著降低AA-FLS Bcl-2 mRNA和蛋白的表达、并使Bax和Caspase3 mRNA和蛋白水平有明显提高;紫外分光光度法结果也表明DMHP体外能剂量依赖性地提高AA-FLS Caspase3活性;胞外无Ca2+时,[Ca2+]i在DMHP给药前后略有增加但无统计学差异,而胞外有Ca2+时,[Ca2+]i缓慢增加,统计学结果表明[Ca2+]i在DMHP给药前后有显著差异。结论:DMHP体内、体外均能显著抑制滑膜细胞增殖、诱导滑膜细胞凋亡,这可能是DMHP控制AA大鼠增生性滑膜炎的关键。调节Bcl-2/Bax的表达、促进Caspase3表达和活化以及促进胞外钙离子内流、引起[Ca2+]i升高是DMHP促进滑膜细胞凋亡的可能机制。
