黄芪多糖和白术多糖及其硒化衍生物增强免疫和抗氧化活性的研究

硒化多糖具有增强免疫、抗氧化、抗衰老和抗肿瘤等多种功能,其生物活性要高于多糖和硒的单独作用,并且更易被吸收。本研究首先提取纯化择黄芪多糖和白术多糖,筛选出增强免疫和抗氧化的活性部位,然后进行硒化修饰,分别得到9个硒化黄芪多糖(sAPS1～sAPS9)和9个硒化白术多糖(sAMP1～sAMP9),进一步通过体外、体内试验比较它们的增强免疫和抗氧化活性。本研究的目的,旨在验证硒化修饰提高黄芪多糖和白术多糖的增强免疫和抗氧化活性的可能性,筛选出活性最强的硒化多糖及其最佳修饰条件,为研制新型免疫增强剂和抗氧化剂提供理论依据。试验分为以下八个部分:试验Ⅰ、黄芪多糖和白术多糖的提取和纯化用水煎醇沉法提取黄芪总多糖(APSt)和白术总多糖(AMPt),用三氯乙酸法去蛋白得APSd和AMPd,过DEAE-52层析柱得黄芪纯多糖(APSp)和白术纯多糖(AMPp),用苯酚-硫酸法测定糖含量。结果表明,APSt的提取率为6.60%,APSp的糖含量最高,为76.35%;AMPt的提取率为14.45%,糖含量最高,为56%。试验Ⅱ、黄芪多糖和白术多糖增强免疫活性部位的筛选用MTT法首先测定3个黄芪多糖(APSt、APSd和APSp)和3个白术多糖(AMPt、AMPd和AMPp)对鸡外周血淋巴细胞的安全浓度,取安全浓度范围内5个浓度的各多糖单独作用或与PHA同时加入到淋巴细胞的培养体系中,测定细胞A570值和增殖率的变化。结果显示,多糖单独作用时,APSt组在3个APSs中、AMPp组在3个AMPs中的增殖率最高;多糖与PHA共同作用时,APSt组在3个APSs中、AMPp组在3个AMPs中的增殖率最高。结果表明,各多糖在合适的浓度能单独或协同PHA刺激淋巴细胞增殖,APSt和AMPp的作用最强,是黄芪多糖和白术多糖增强免疫的活性部位。试验Ⅲ、黄芪多糖和白术多糖抗氧化活性部位的筛选分别用清除羟自由基、DPPH法与清除超氧阴离子法对黄芪各多糖(APSt、APSd与APSp)与白术各多糖(AMPt、AMPd与AMPp)进行体外抗氧化能力测定。结果表明,APSt对羟自由基以及超氧阴离子平均清除率在APSs中最高,分别为56.4%和7.02%,APSd组DPPH平均清除率在APSs中最高,为46.18%,AMPp组羟自由基与超氧阴离子平均清除率在AMPs中最高,为64.04%和7.38%,AMPt组DPPH平均清除率在AMPs中最高,为73.90%,结果表明,各多糖在合适的浓度均有不同程度的抗氧化活性,APSt和AMPp的活性最强,分别是黄芪多糖和白术多糖抗氧化的活性部位。试验Ⅳ、黄芪多糖和白术多糖的硒化修饰采用NaSeO3-HNO3法对前两章筛选出来的活性部位AMPt和APSp进行硒化修饰,以NaSe03用量、反应温度、反应时间3因素3水平正交设计9种修饰条件,分别得到9个硒化黄芪多糖sAPS1～sAPS9和9个硒化白术多糖sAMP1～sAMP9。含量测定结果显示,sAMP4、sAPS2的糖含量和硒含量最高。红外光谱鉴定证明两种多糖修饰成功。试验V、硒化黄芪多糖和硒化白术多糖体外增强免疫活性的比较将黄芪各多糖(APSt、sAPS1～sAPS9)和白术各多糖(AMPp、sAMP1～sAMP9)用 MTT 法测出各药的安全浓度;选取安全浓度内5个浓度的各多糖单独或协同PHA加入到鸡淋巴细胞培养系中,用MTT法测出各药的增殖情况。结果显示,sAPSs与sAMPs的最大安全浓度分别为12.5μg·mL-1和6.25μg·mL-1,单糖单独作用于细胞时,硒化各多糖的增殖率都高于硒化前多糖,其中,sAPS5在0.781～12.50μg·mL-1浓度下的A570值都显著大于细胞对照组,增殖率在硒化黄芪多糖中最高,sAMP9在0.390～6.250μg·mL-1浓度下的A570值都显著大于细胞对照组,增殖率在硒化白术多糖中最高;与PHA协同作用时,硒化各多糖各浓度的A570值显著高于细胞对照组,sAPS5和sAMP9分别为硒化黄芪多糖和硒化白术多糖中增殖率最高的多糖组。结果表明,硒化修饰可以提高黄芪多糖和白术多糖的体外增强免疫活性,sAPS5和sAMP9活性最强。试验Ⅵ、硒化黄芪多糖和硒化白术多糖体外抗氧化活性的比较分别用清除羟自由基、DPPH法和ABTS法对黄芪各多糖(APSt、sAPS1～sAPS9)和白术各多糖(AMPp、sAMP1～sAMP9)进行体外抗氧化能力测定。结果显示,sAPS1～sAPS9在0.125～1.0 mg·mL-1、sAPS1～sAPS8在0.0625 mg·mL-1清除羟自由基的能力显著大于APSt,sAMP1～sAMP9 在 0.5～1.0 mg·mL-1、sAMP3～sAMP7 在 0.0625～0.25 mg·mL-1清除羟自由基的能力显著大于AMPp;sAPS1～sAPS9在0.125～1.0 mg·mL-、sAPS1～sAPS8在 0.0625 mg.mL-1清除DPPH自由基的能力显著大于APSt,sAMP1～sAMP9在0.5～1.0 mg·mL-1、sAMP4～sAMP9 在 0.0625～0.25 mg.mL-1 清除 DPPH 自由基能力显著大于 AMPp;sAPS1～sAPS9 在 1.0 mg·mL-1 和 0.0625 mg·mL-1、sAPS1～sAPS8 在0.125～0.5 mg·mL-1清除ABTS自由基的能力显著大于APSt,sAMP4～sAMP8在0.125～1.0 mg·mL-1、sAMP6 在 0.0625 mg·mL-1、sAMP9 在 0.25～1.0 mg·mL-1 对清除ABTS自由基的能力显著大于AMP。结果表明,硒化修饰能提高黄芪多糖和白术多糖的体外抗氧化活性,sAPS8和sAMP6的活性最强。试验Ⅶ、硒化黄芪多糖和硒化白术多糖体内增强免疫活性比较 14日龄雏鸡180羽随机分为6组,除空白对照组(BC)外均用新城疫疫苗免疫。28日龄二免。在每次免疫的同时,4个多糖组分别每只注射2 mg·mL-1的sAMP9、sAPS5、AMPp和APSt溶液0.5 ml,免疫对照组(VC)和BC注射同量的生理盐水。分别于首免后第7、14、21、28d采血,测定淋巴细胞增殖、血清抗体效价、IL-2、IL-6和IFN-γ的含量。结果显示,sAMP9和sAPS5组的淋巴细胞增殖率、抗体效价、IL-2含量、IL-6含量以及IFN-γ含量均高于或显著高于未修饰AMPp和APSt组。结果表明,硒化修饰能显著提高黄芪多糖和白术多糖的增强免疫活性,sAMP9的活性最强。试验Ⅷ、硒化黄芪多糖和硒化白术多糖体内抗氧化活性比较 14日龄雏鸡180羽随机分均为6组,除空白对照组(BC)外均用新城疫疫苗免疫。28日龄二免。在每次免疫同时,4个多糖组分别每只分别注射sAMP6、sAPS8、AMPp和APSt溶液1 mg(0.5 ml),免疫对照组(VC)和BC组注射相同剂量的生理盐水。分别于首免后第7、14、21、28 d翼静脉采血,分离血清,测定SOD、MDA、GSH-Px和CAT的含量。结果显示,在D7～D28sAMP6组和sAPS8组SOD、GSH-Px和CAT的含量均高于或显著高于未修饰的AMPp和APSt组、VC和BC组,MDA含量低于或显著低于未修饰的AMPp和APSt组、VC和BC组。结果表明,硒化修饰能显著提高的AMPp和APSt的抗氧化活性,sAMP6的活性最强。