奶牛乳腺组织体外培养体系的建立及MET对其酪蛋白as1基因表达的影响

本课题以泌乳奶牛乳腺组织为研究材料，在泌乳奶牛乳腺组织的体外培养方法选择（试验一）和用于测定奶牛乳腺组织酪蛋白αs1基因mRNA表达量RT-PCR法的构建（试验二）进行了研究；并利用建立的方法，研究、探讨了体外培养的奶牛乳腺组织对泌乳素刺激的应答性（试验三）与蛋氨酸对体外培养奶牛乳腺组织酪蛋白αs1基因表达的影响（试验四）。 1．泌乳奶牛乳腺组织体外培养方法的建立（试验一） 用组织块旋转培养法与贴壁培养法对液氮冷冻复活组织进行培养，培养条件为：DMEM／F12培养液中含2μg／ml氢化可的松、5μg/ml转铁蛋白、10μg／ml胰岛素和10％的胎牛血清。通过台盼蓝染色观察（旋转培养法）、培养组织观察、拍照（贴壁培养法）、MTT法活性测定，发现旋转培养法在120h后组织、细胞成活率都较高，MTT值与基因组DNA降解值显示在72h内组织的活性最高；贴壁培养法培养的组织、细胞在24h开始贴壁，到48h后完全贴壁成活，72h后组织具有明显分泌活性，MMT值与基因组DNA降解值显示，72h以后奶牛乳腺组织已表现增殖能力、死亡率明显下降，96小时后培养组织的增殖能力与死亡率都达到稳定状态。 研究证实，奶牛乳腺组织贴壁和旋转两种培养方法都可以保持奶牛乳腺组织基本活性，其中旋转培养方法操作比较简单，培养时可立刻对组织进行试验处理，试验周期短，旋转培养的组织量大，可以满足对组织需求多的试验，但组织存活时间较贴壁培养短，对组织、细胞的分裂增殖状况无法进行形态观察；贴壁培养方法，组织存活时间长，便于进行形态观察，但组织完全贴壁需要48h，72h后处于稳定状态，才能够开始进行处理，试验周期长。 2．酪蛋白αs1基因及持家基因GAPDH的扩增、序列分析及RT-PCR条件探讨（试验二） 2（）()4年浙汪人学倾卜学位沦文 根据己报道的黑白花奶牛酪蛋白a、: （GAPDH）基因序列， 的乳腺中提取总RNA， 别获得434bp与584bp 分别设计了酪蛋白Q 和持家基囚三磷酸甘油醛脱氢酶 、.mRNA和GAPDH的引物，从奶牛 经反转录一聚合酶链式反应 的片段，纯化后，利用上、 （RT一PCR） 下游引物对 测序结果与报道序列比较表明， 扩增所获片段为酪蛋白 个氨基酸组成的多月太， 进行cDNA扩增，分 PCR产物直接测序， 基因与GAPDH基因 cDNA的部分序列，其中编码130 是成熟肤的主体部分。 本研究得到的酪蛋白Qs，扩增片段与报道的奶牛酪蛋白Qs，基因相比，一个碱基 发生变异，其它序列完全一致，所得的GAPDH扩增片段与报道序列完全一致。 利用设计的引物分别探讨了PCR体系中适宜的Mgcl:浓度、循环数及引物浓 度。试验发现酪蛋白。s，基因适宜MgC12浓度为1 .0~ol/l，循环数为30，引物 浓度为0.4林mol/l;GApDH基因适宜MgCI:浓度为1 .srnmol/l，循环数为30，引物 浓度为0.6林mol/l。构建了优化的Rl’- pCR法，用于奶牛乳腺组织酪蛋白Q 51基因 mRNA表达量的测定。 3.半定量RT-PCR法评定体外培养的奶牛乳腺组织对泌乳素的应答 性（试验三）_ 利用旋转培养法，培养条件同试验一，泌乳素添加剂量为5.0拼g/m1，于培 养4、8、12、24h时分别取样，提取总RNA，采用构建的RT一PCR法，检测各培 养时间奶牛乳腺组织酪蛋白Q 51基因对泌乳素的应答性。结果表明酪蛋白as，基 因mRNA表达量在sh达到高峰，与4、12、24h相比均有显著差异(p（0.01）。这 一结果与以前报道的奶牛乳腺组织对泌乳素不同时间点的应答性相一致。 利用同样的培养方式，泌乳素添加水平分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0协g/m1， 培养24h后提取总RNA，采用构建的RT一PCR方法，检测不同处理组奶牛乳腺组 织酪蛋白a，，相对于GAPDH的基因mRNA表达量来评定体外培养液氮复活奶牛乳 腺组织对泌乳素刺激的应答性。结果经SAS统计表明处理组比对照组分别提高 25.6%（p<0.01）、68%（p<0.01）、74%（p<0.01）和78%（p<0.01），2.5林g/ml剂量组 与5.0、7.5、10.0组之间差异极显著，但5.0、7.5、10.oug/m1剂量组之间差 异不显著，因此该培养条件下5.0拼g/m1的添加剂量最佳。 由以上结果可知，体外培养液氮复活的奶牛乳腺组织对泌乳素具有良好的应 答性。 2（）()4年浙梦工大学了‘!f学位沦文 4.半定量RT-PCR法评定蛋氨酸对奶牛乳腺细胞酪蛋白Q，:基因表达 的影响（试验四） 利用旋转培养法，培养条件同试验一，不同处理组蛋氨酸水平分别为20（对 照组）、40、80、160拼g/m1，培养24h后提取总RNA，采用构建的RT一pCR法，检 测不同处理组奶牛乳腺组织酪蛋白Qs，相对于GAPDH的基因mRNA表达量。结果 经sAs统计表明:与对照组相比，蛋氨酸40林g/m1、80抖g/ml显著提高酪蛋白asl mRNA表达量（p<0.01），而蛋氨酸160林g/m1组与其它处理组（对照组除外） 相比显著抑制了酪蛋白asl基因的表达水平（p<0 .01），其中以蛋氨酸80林g/m1 组表达水平最高。 因此，蛋氨酸低于80林g/m1时育濒提高体外培养奶牛乳腺组织酪蛋白。s，基因 的表达水平，160ug/m1时有抑制作用。 综上所述:旋转培养和贴壁培养在4Sh内都能保持奶牛乳腺组织的活性;可 以通过RT一PCR方法测定奶牛乳腺组织的酪蛋白Q，，基因mRNA表达丰度;泌乳素 的添加量为5林g/