纤维素酶高产菌选育及固态发酵条件研究

本实验采用滤纸平板法从“三北”防护林永寿试验区所采20个人工林表层土样中分离出木霉15株、青霉10株和毛壳菌25株，与本实验室保存的F2（烟曲霉）和A8（黑曲霉）一起进行筛选；对筛选得到6株酶活较高的木霉10、木霉11和A8进行紫外线诱变，青霉1、青霉3和F2进行亚硝酸和紫外线两种方式诱变；通过刚果红染色透明圈法筛选、发酵产物酶活性测定，获得H8和5x6.9 2株酶活较高的优良突变株；对这2个突变株菌进行碳氮源试验；对分离出的25株毛壳菌固体发酵产物进行纤维素酶及蛋白质含量测定；研究了添加复合发酵剂对奶牛原饲料发酵产物蛋白质含量的影响；研究了尿素溶液和饱和石灰水预处理秸秆粉对纤维素酶活性影响。结果表明： 1 从供试分离源通过滤纸平板法分离所得青霉1、青霉3和木霉10、木霉11是4株优良的产纤维素酶野生真菌，分解纤维素能力较强。 2 青霉1、青霉3和烟曲霉F2分别经紫外线和亚硝酸诱变，各突变株在微晶纤维素平板上的透明圈直径表现为亚硝酸诱变突变株透明圈平均直径（18.67mm、31.42mm、21.71）大于紫外线诱变突变株平均直径(14.70mm、17.87mm、5.13mm)，t检验表明，菌株青霉3和烟曲霉F2的紫外线诱变突变株透明圈直径与亚硝酸诱变变突变株透明圈直径间存在显著性差异（t青3＝5.168﹡﹡﹥t0.01=2.690，n=45；tF2＝9.221﹡﹡﹥t0.01=2.724，n=37）。 3 以青霉1、青霉3、木霉10、木霉11、黑曲霉A8和烟曲霉F2为出发菌株进行诱变处理共得到167株突变株，其中的61株菌的微晶纤维素平板透明圈直径与CMC及FPA酶活的相关性分别达到极其显著和显著性水平（tCMC=0.476﹡﹡﹡，tFPA=0.316﹡， n=61，t0.05＝0.308，t0.01＝0.377）。因此，在筛选纤维素酶活高产菌时可用刚果红染色透明圈直径作初筛指标。 4 选育所得突变株H8和5x6.9是两株纤维素酶活较高的菌株，其CMC酶活分别是101.83和149.48IU/g，FPA酶活分别是5.58和8.00IU/g。 5 培养基成分对纤维素酶活有显著影响。突变株H8在小麦秸秆粉和稻草秸秆粉与麸皮比例为6：4时CMC及FPA酶活均达到最高，分别为123.1 IU/g及12.11 IU/g和132.6 IU/g及14.96 IU/g；5x6.9在稻草秸秆粉与麸皮比例为9：1和小麦秸秆粉与麸皮比例为8：2时，CMC及FPA酶活达到分别为133.9 IU/g及15.70 IU/g和142.8 IU/g及12.61 IU/g。采用无机氮源纤维素酶两组酶活大于采用有机氮源；无机氮源中 (NH4)2SO4作为氮源较NH4NO3 作氮源纤维素酶活高。 6小麦秸秆预处理试验表明，小麦秸秆粉经尿素溶液和饱和石灰水浸泡后发酵能显著提高发酵产物纤维素酶活，其CMC及FPA酶活较对照（清水浸泡）提高300％和91.0%及630％和1270%。其尿素溶液的最适浸泡条件为浓度50g/L、时间48h、温度10℃，饱和石灰水的最适浸泡条件为时间48h、温度10℃。 7 25株毛壳菌的产酶试验表明，毛壳菌纤维素酶活较低，不适于作为纤维素酶产生菌；但有些毛壳菌（例如13.18、17.46、04.11）在秸秆基质上，菌丝生长旺盛，发酵产物纯蛋含量白提高幅度大，故可作为微生物饲料蛋白生产菌种。 8 奶牛原饲料经复合发酵剂发酵处理纯蛋白含量明显提高。复合发酵剂添加量、发酵时间和发酵模式对发酵产物纯蛋白含量影响较大，随着复合发酵剂用量增加，发酵产物纯蛋白含量先增后减趋势；向奶牛原饲料中添加复合发酵剂，采用模式Ⅱ低温低含水量加氮发酵，可抑制细菌大量繁殖引起的酸败变质，有利于菌体生长和纯蛋白含量大幅度提高（提高19.2％）。奶牛饲料的最适预发酵条件为复合发酵剂量10g/kg，添加氮素，温度30℃，时间48h.，水：料=2.5：3。