OA是与老龄化相关的最流行的关节疾病,致残率高,其发病机制目前仍未完全明了。软骨退变为OA关节退变最大特征之一,软骨细胞的生理变化成为研究的核心。在软骨细胞中线粒体不仅为细胞产生能量,而且介导其他关键的生物学行为,在这些生物过程中它可从自噬、老化、细胞死亡影响OA进展,线粒体功能失调严重影响软骨细胞存活,也是OA发病的关键环节。异常的线粒体主要通过线粒体自噬(mitophagy)降解,因此mitophagy可维持线粒体健康体系均衡,是软骨细胞内环境稳态及存活重要调节机制。但是mitophagy在OA中的作用还不明确。目的:观察环孢素A(CsA)抑制软骨细胞线粒体自噬对骨关节炎相关蛋白基质金属蛋白酶1(MMP-1)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)表达的影响。方法:临床上被诊断为骨关节炎(OA)并行膝关节置换病人,行膝关节置换手术会根据手术需要截下带有软骨的表面骨,将带有软骨的胫骨平台和股骨内外髁在无菌状态下低温送到实验室,在超净工作台分离、培养膝关节软骨细胞。由于Ⅱ型胶原蛋白与蛋白聚糖为软骨细胞标志性分泌物,而且甲苯胺蓝可将含有蛋白聚糖的细胞染成紫蓝色,所以采用甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫荧光染色法两种方法对软骨细胞进行鉴定。OA为无菌性炎症疾病,为模拟OA膝关节内炎症微环境,采用白介素1β(IL-1β)在体外刺激软骨细胞,另外CsA为抑制线粒体自噬的常用工具药,所以在IL-1β刺激软骨细胞的条件下同时,通过CsA抑制线粒体自噬发生,分为只加入细胞培养基的对照组、IL-1β组、IL-1β+CsA组。当线粒体自噬水平增高时,线粒体减少,同时线粒体蛋白也减少,Tom20是线粒体上稳定表达的蛋白。用Mitotracker Deep Red(MTR)标记线粒体与Lysotracker green(LTG)标记自噬体的免疫荧光共定位以及Tom20蛋白表达量比较线粒体自噬水平;MMP-1、MMP-13均参与OA软骨退变,是与OA进展密切相关性的标志性蛋白,用Real-time PCR法检测MMP-1、MMP-13的mRNA的表达,用Western blot法检测MMP-1、MMP-13、Tom20蛋白的表达。结果:与对照组相比IL-1β组MTR和LTG荧光共定位增加,线粒体外膜蛋白Tom20减少(P<0.05),线粒体自噬增加,而MMP-1、MMP-13的mRNA和蛋白表达增加(P<0.05),说明当IL-1β刺激软骨细胞时,可作用于线粒体并使线粒体自噬增加,同时也使MMP-1、MMP-13表达增加。与IL-1β组相比IL-1β+CsA组MTR和LTG荧光共定位减少,Tom20蛋白增加(P<0.05),线粒体自噬减少,MMP-1、MMP-13的mRNA和蛋白表达均增加(P<0.05)。说明CsA可以抑制IL-1β所引起的软骨细胞线粒体自噬,另外抑制线粒体自噬发生使MMP-1、MMP-13的表达进一步增加。结论:IL-1β可使软骨细胞中mitophagy和MMP-1和MMP-13的表达增加;CsA可以抑制软骨细胞线粒体自噬;抑制mitophagy使骨关节炎相关蛋白MMP-1和MMP-13的表达增加。
