湖北麦冬多糖质量控制与抗糖尿病活性研究

湖北麦冬,又名山麦冬,来源于百合科植物湖北麦冬Liriope spicata var. prolifera的干燥块根,收载于现行版《中华人民共和国药典》(2010年版),是中国卫生部公布的即可作药物也可作保健食品的品种,主产于湖北省襄樊市。它最早以“随州麦门冬”之名记载于宋代《证类本草》之中,是一种常用的抗糖尿病中药。 多糖的质量控制是多糖研究的重点和难点,现阶段没有很好的方法对多糖进行非常准确的质量控制。仅仅采用总糖含量控制多糖质量已经远远不能满足当下科技发展的需求。质量控制研究也是湖北麦冬多糖作为一种新药开发过程中的核心问题,与能否保证其药材质量、生产环节稳定、制剂过程稳定以及最后产品质量等多个方面都有密切关系。同时,有效的质量控制是保证其药效的前提。研究表明,湖北麦冬多糖(TLSP)是由两种均一多糖组成的,两种均一多糖的结构类似,主链都是由果糖残基通过1-2链接而成,支链通过O-6链接一个果糖残基,链末端都是由葡萄糖残基和果糖残基构成,分子量分别接近3KDa和5KDa。基于以上信息,本文尝试多种技术手段,对湖北麦冬多糖进行质量控制。 实验室前期工作已证实,湖北麦冬水溶液中的多糖成分具有降低小剂量链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠血糖值和改善胰岛素抵抗的作用。TLSP和两种均一多糖在KKAy自发性糖尿病小鼠模型中都有很好的降血糖效果,而且三者之间没有显著性差异。但前期试验都是采用小鼠作动物模型,由于血液和组织样本量有限,对湖北麦冬多糖的疗效和作用机制研究都不够完善。如2010年开始,美国糖尿病协会把糖化血红蛋白推荐为诊断糖尿病的首要指标,前期试验中对该指标未进行测定；且对糖尿病并发症未进行研究；仅对胰岛素信号上游信号进行测定,信号通路研究不完全。鉴于以上原因,本研究选用高脂高糖饲料加小剂量STZ诱导的糖尿病大鼠这一更加稳定的模型,对湖北麦冬多糖抗糖尿病活性进行全面研究,以及深入探究其作用机理。 本论文主要由四个部分组成。 第一部分：通过下述5个方面对湖北麦冬多糖原料药进行质量控制,以保证其质量稳定。(1)单糖组成TLC分析,湖北麦冬多糖原料药进行TCL分析时,显现与果糖标准品和葡萄糖标准品相同位置和相同颜色的斑点,其他标准单糖位置无斑点。(2)分子量测定,采用高效凝胶渗透色谱-蒸发光散射检测器(HPGPC-ELSD)法对分子量进行测定,规定湖北麦冬多糖原料药的重均分子量在3000-5000Da之间。(3)总糖含量测定,选用果糖作标准品,采用蒽酮-硫酸法对湖北麦冬多糖原料中总糖含量进行测定,规定湖北麦冬多糖原料药中总糖含量必须大于或等于95%。(4)单糖含量高效液相色谱(HPLC)分析,考察了两种HPLC方法对湖北麦冬多糖中的单糖组成和含量分析,最后选用反相-高效液相色谱/紫外检测器(RP-HPLC/UVD)法测定湖北麦冬多糖中的果糖和葡萄糖含量,规定湖北麦冬多糖中果糖含量必须在98%-104%之间,葡萄糖含量必须在4%-6%之间。(5)杂质检测,湖北麦冬多糖原料药HPGPC图谱须为单一色谱峰,在11-14min(无机盐峰)和18-21min(单糖峰)处无明显色谱峰出现；湖北麦冬多糖水溶液(5mg/mL)紫外扫描后在260-280nm处不得有明显的蛋白质吸收峰。 第二部分：高脂高糖饲料+小剂量链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型被用作湖北麦冬多糖抗糖尿病活性评价,研究结果表明湖北麦冬多糖可显著降低糖尿病大鼠的空腹血糖值和糖化血红蛋白值,且能显著改善糖耐量,进一步确认了湖北麦冬多糖的降血糖疗效。对血脂的研究结果表明湖北麦冬多糖具有降低糖尿病大鼠血脂的功能。本研究还发现,湖北麦冬多糖能改善糖尿大鼠肾脏的各项功能参数,同能也能预防糖尿病大鼠脂肪肝的发生与发展,表明湖北麦冬多糖对糖尿病的并发症有预防作用。 第三部分：免疫组织化学、免疫蛋白印迹电泳法、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)等技术被用于湖北麦冬多糖抗糖尿病活性作用机理研究。作用机理主要如下：(1)对胰岛素信号传导的影响。湖北麦冬多糖能显著提高糖尿病大鼠肝脏中胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶(P13K)、蛋白激酶B (Akt)、葡萄糖转运蛋白4(Glut4)的表达水平,降低糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的表达水平,改善胰岛素信号传导。(2)对肝脏葡萄糖代谢的影响。湖北麦冬多糖能使糖尿病大鼠的肌糖原和肝糖原含量增加,同时使肝脏葡萄糖激酶(GK)和糖原合成酶(GS)活性及mRNA表达增加,葡萄糖-6-磷酸激酶(G-6-Pase)和糖原磷酸化酶(GP)活性及mRNA表达降低,改善肝糖代谢紊乱。(3)对氧化应激环境的影响。湖北麦冬多糖能显著增加糖尿病大鼠的血清SOD、CAT、 GSH-px活性,降低血清MDA浓度,改善机体氧化应激水平。这些都有可能是湖北麦冬多糖抗糖尿病的作用机理。(4)预防并发症的初步机制。下调糖尿病大鼠体内AGE-RAGE系统的表达可能是湖北麦冬多糖预防糖尿病并发症的主要原因。 第四部分：本部分内容就常见多糖质量控制方法和2009年至2014年有关抗糖尿病活性多糖的报道进行了综述总结,希望能够为抗糖尿病活性多糖的研究和开发提供一定的参考。