目的观察左归丸对绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)模型大鼠胫骨和下丘脑中β2肾上腺素受体(β2-adrenergic receptor,β2-AR)mRNA及蛋白水平的表达,探讨PMOP的可能发病机制和左归丸的药效及可能的作用机制,为左归丸治疗PMOP的临床应用提供理论和实验参考。方法50雌性SD大鼠随机分为假手术组10只和造模组40组,去势法建立绝经后骨质疏松症大鼠模型。根据造模情况,将剩余36只造模组大鼠随机分为模型组,雌二醇组,左归丸低剂量组和左归丸高剂量组,每组9只。灌胃给药12周后,通过显微CT(μ-CT)检测股骨骨密度和松质骨三维形态结构及骨参数(骨体积分数(bone volume fraction,BV/TV),骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th),骨小梁数量(trabecular number,Tb.N),骨小梁间隙(trabecular Separation,Tb.Sp));苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色法观察大鼠骨组织形态学变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清骨转换标志物骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP),1型胶原羧基端肽交联((βcross-linked C-telopeptide of type 1 collagen,β-CTX),抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tarte-resistant acid phosphatase,TRAP-5b)的含量;实时荧光定量PCR(qPCR)检测大鼠胫骨及下丘脑β2-AR,骨保护素(osteoprotegerin,OPG),核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NK-κB ligand,RANKL)mRNA 表达水平;蛋白印迹试验(Western blot,WB)检测大鼠胫骨及下丘脑β2-AR,胫骨OPG,RANKL蛋白表达水平。结果(1)骨密度:与假手术组相比,模型组大鼠股骨骨密度显著降低(P<0.01);与模型组相比,左归丸高低剂量组和雌二醇组大鼠股骨骨密度显著升高(P<0.05;P<0.01),但三组间差距不具统计学意义(P>0.05)。(2)骨组织形态学:μ-CT三维图像示,与假手术组相比,模型组大鼠骨小梁明显稀疏,数目减少,变细,断裂,间距加宽,骨小梁结构出现较大的空白区域。与模型组相比,左归丸高低剂量组和雌二醇组骨小梁变密,连续性增加,空隙率下降,微观结构明显改善。HE染色示,与假手术组相比,模型组大鼠骨小梁明显稀少,变细,结构不完整,排列疏松,存在大量空骨陷窝,小梁间距变宽。与模型组相比,左归丸高低剂量组和雌二醇组骨小梁数量明显增多,分布均匀,结构较完整,排列尚可,小梁空骨陷窝减少,间距变窄。(3)松质骨参数:与假手术组相比,模型组大鼠BV/TV,Tb.Th和Tb.N均明显降低(P<0.01)而Tb.Sp明显升高(P<0.01);与模型组比较,左归丸高低剂量组和雌二醇组BV/TV,Tb.Th,Tb.N均显著升高(P<0.01)而Tb.Sp显著降低(P<0.01);与雌二醇组相比,左归丸高低剂量组以上各项指标差距不大,没有统计学意义(P>0.05)。(4)血清骨代谢指标:与假手术组相比,模型组大鼠血清BALP明显降低(P<0.01)而β-CTX,TRAP-5b明显升高(P<0.01);与模型组相比,左归丸高低剂量组和雌二醇组大鼠血清BALP显著升高(P<0.01)而β-CTX,TRAP-5b显著降低(P<0.01);与雌二醇组比较,左归丸低剂量组血清TRAP-5b升高(P<0.05),余无明显差别(P>0.05)。(5)mRNA表达:与假手术组相比,模型组大鼠胫骨及下丘脑OPG mRNA表达水平显著降低(P<0.01;P<0.05)而β2-AR,RANKL mRNA表达水平均显著升高(P<0.01;P<0.05);与模型组相比,左归丸高低剂量组和雌二醇组大鼠胫骨及下丘脑OPG mRNA表达水平升高(P<0.05;P<0.01)而β2-AR,RANKL mRNA表达水平均有不同程度降低(P<0.01;P<0.05);与雌二醇组相比,左归丸高低剂量组大鼠下丘脑β2-AR mRNA表达水平升高(P<0.05),余差异不显(P>0.05)。(6)蛋白表达:与假手术组相比,模型组大鼠胫骨及下丘脑β2-AR蛋白表达水平显著升高(P<0.01),胫骨RANKL蛋白表达水平也显著升高(P<0.01)而胫骨OPG蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与模型组相比,左归丸高低剂量组和雌二醇组大鼠胫骨及下丘脑β2-AR蛋白表达水平均不同程度降低(P<0.05;P<0.01),胫骨RANKL蛋白表达水平也显著降低(P<0.01)而胫骨OPG蛋白表达水平升高(P<0.01;P<0.05);与雌二醇组相比,左归丸高低剂量组以上各项指标均无明显差异,没有统计学意义(P>0.05)。结论(1)PMOP的形成与交感神经兴奋性提高,激活骨组织及下丘脑中的β2-AR,进而影响OPG/RANKL/RANK系统存在相关性。(2)左归丸可通过抑制骨吸收,促进骨形成,从而逆转PMOP高转换型骨状态,提高骨质量,延缓骨量流失。(3)左归丸通过降低骨组织和下丘脑中的β2-AR水平,抑制交感神经的兴奋性,从而影响OPG/RANKL/RANK系统,进而影响骨重建可能是其治疗PMOP的机制之一。
