柑橘精油抗氧化特性及对皮肤细胞氧化损伤的保护作用研究

本研究从夏橙、椪柑、柠檬、蜜柑果皮中提取精油,对精油成分构成进行差异分析,采用高速逆流色谱(HSCCC)分离椪柑精油主要成分;以两种体外抗氧化测试方法评价柑橘精油及其主要成分的抗氧化特性;构建人皮肤成纤维细胞氧化损伤模型以探究精油及活性成分对细胞的保护作用,以期为柑橘精油在护肤方向的应用提供一定的理论基础。全文主要结果如下:1.柑橘精油的提取分离及成分差异分析采用压榨法和水蒸汽蒸馏法提取果皮精油,以气相色谱-质谱联用(GC-MS)鉴定精油成分并进行差异分析。(1)水蒸汽蒸馏法精油提取率高于压榨法,且前者提取的精油成分中含氧化合物比例明显高于压榨精油。精油样品中共鉴定出48种挥发性成分,不同柑橘品种和提取方法获取的精油其成分构成和相对含量都有所差异。α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯和金合欢烯在所有精油样品中都被检出,同时,每个品种精油都具有独特的标记成份可区别于其它品种。(2)采用高速逆流色谱法分离椪柑压榨精油,筛选出石油醚-乙腈-丙酮(5:3:2)作为溶剂体系,分离得到β-月桂烯、柠檬烯和γ-松油烯三种成分,其中β-月桂烯浓度由3.8%提高到64.9%,柠檬烯浓度由74.9%提高到87.1%,γ-松油烯浓度由9.7%提高到50.5%。2.柑橘精油抗氧化特性评价采用DPPH自由基清除法和TBARS法评价柑橘精油及十种主要成分的抗氧化特性。柑橘精油清除DPPH自由基的能力和抗脂质过氧化能力呈现出浓度依赖性,四个品种中椪柑精油效果最优。精油的抗氧化活性与成分中萜烯化合物与含氧化合物的比值相关。总体上,柑橘精油及其活性成分在TBARS试验中比在DPPH自由基清除试验中表现出更低的EC50值。两种单萜烯,γ-松油烯和萜品油烯在浓度为100μL/m L时,对DPPH自由基的清除率分别达到了75.8%和64.2%,其抗氧化指数分别为94.8%和88.2%,活性与抗氧化剂BHT接近。3.柑橘精油对皮肤细胞氧化损伤的保护作用研究(1)精油浓度>0.3μL/m L时会显著降低细胞存活率,低于该浓度的精油整体上表现一定程度的细胞增殖作用。单体成分中除α-蒎烯和3-蒈烯对细胞有较大毒性外,其它成分表现出不同程度的细胞增殖作用,并确定以含量丰富且活性较高的柠檬烯和γ-松油烯进行后续实验。(2)以外源性过氧化氢构建人皮肤成纤维细胞氧化损伤模型,采用MTT法研究过氧化氢对细胞存活率的影响。结果表明:过氧化氢能够显著降低细胞活力且与浓度正相关,根据细胞存活率结果最后确定氧化损伤诱导条件为:0.65 m M/0.33 m M过氧化氢诱导6 h。(3)椪柑精油预处理对成纤维细胞的损伤有一定的防护作用,使细胞活力从54.9%增加到58.8-71.9%。而精油与过氧化氢共孵育试验中,0.1μL/m Lγ-松油烯表现出最佳的保护效果,使细胞活力从24.5%恢复到83.1%。两组试验中椪柑精油及其活性组分都显著降低了细胞中MDA含量,且抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活力得到不同程度的提高。揭示精油可能通过直接清除活性氧自由基而降低细胞氧化损伤程度,也可能通过增强细胞内源性抗氧化酶的活力而发挥抗氧化保护作用。