大豆异黄酮的抑菌活性及其机制的研究

大豆异黄酮(soybean isoflavone,SI)是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物,主要分布在大豆种子的子叶和胚轴,现已经证明SI具有多种生物学活性,其中SI的抑菌活性目前已有较多的报道,但对其抑菌机制研究较少。本文利用杯碟法和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法,测定了SI的抑菌活性;通过扫描电镜与透射电镜、呼吸代谢抑制实验、SDS-PAGE蛋白谱带变化、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色法、DNA超螺旋解旋方法等研究了SI的抑菌机制。主要实验结果如下: (一)大豆异黄酮的抑菌活性 1、大豆异黄酮对不同细菌的抑菌活性 SI对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、白色念珠菌、单增李氏菌、米曲霉和犁头霉均有明显的抑制作用,但对大肠杆菌和酵母菌无抑制作用。 2、大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度当SI终浓度为0.3mg/mL时,金黄色葡萄球菌的生长被完全抑制,因此确定该浓度即为SI的最低抑菌浓度。 (二)大豆异黄酮的抑菌机制 1、大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌形态结构的影响扫描电镜观察,SI作用金黄色葡萄球菌24h后,菌体表面部位出现皱缩、干瘪、扭曲变形、囊泡状或不规则形状的突起以及缢痕等结构。 2、大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌超微结构的影响透射电镜观察,SI处理4h后,金黄色葡萄球菌的细胞质开始固缩,14h后有明显的质壁分离现象,并出现空腔,24h后细胞壁和细胞膜破裂,破裂处有内容物溢出。 3、大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌细胞膜渗透性的影响培养液电导率的改变可以反映细胞膜渗透性的改变。SI作用菌体1h后,培养液的电导率开始增加,当SI作用菌体6h后,培养液的电导率变化率达到4.61%。表明菌体细胞内有细胞质的渗漏。推测其原因可能是SI改变了细胞膜的通透性所致。 4、呼吸代谢抑制实验 该实验结果表明,大豆异黄酮和丙二酸、碘乙酸、磷酸钠的叠加抑制率分别为8.6%、16.4%和22.1%,由于大豆异黄酮和丙二酸的叠加率最小,因此,大豆异黄酮主要是通过抑制供试菌株糖代谢途径中的三羧酸循环途径而起作用。 5、大豆异黄酮对菌体蛋白质合成的影响 蛋白谱带分析结果显示,SI可抑制金黄色葡萄球菌的蛋白质合成,使其蛋白总量随作用时间的延长呈下降趋势,尤其是较大分子量的蛋白含量下降显著,其蛋白量与对照组相比减少了90.1%。 6、大豆异黄酮对菌体DNA、RNA含量的影响 DAPI荧光染色结果显示,SI作用28h后,金黄色葡萄球菌菌体内的核酸含量呈明显下降趋势,其中与对照组相比,DNA量减少了33.53%,RNA量减少了39.82%。 7、大豆异黄酮对菌体DNA拓扑异构酶活性的影响 SI能明显抑制拓扑异构酶Ⅰ(TOPOⅠ)和拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)介导的DNA解旋,SI在6.4mg/mL时完全抑制TOPOⅠ和TOPOⅡ活性,同时在3.2mg/mL时还能直接引起pBR322DNA的双链断裂。 SI对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性,其抑菌机制可能是通过破坏细菌细胞壁及细胞膜的完整性、抑制细菌的呼吸代谢,同时抑制TOPOⅠ和TOPOⅡ活性来进一步抑制菌体DNA、RNA和蛋白质的合成来实现的。