补肾强督治偻方调节强直性脊柱炎骨代谢的临床与机制研究

目的:1.采用阳性药对照的临床随机对照研究,客观评价补肾强督治偻方综合方案改善肾督虚寒型强直性脊柱炎骨代谢变化的临床疗效及安全性,揭示其骨保护潜能,并为后期大样本、多中心的随机对照试验提供参考。2.利用网络药理学预测补肾强督治偻方治疗强直性脊柱炎的骨代谢调节作用信号通路及靶点,为后续研究奠定工作基础。3.基于网络药理学的研究结果,通过细胞实验初步探讨补肾强督治偻方调节强直性脊柱炎骨代谢可能的分子机制。方法:1.临床研究采用临床随机对照研究方法,纳入中医证候肾督虚寒证强直性脊柱炎患者34例,分为中医试验组和西医对照组,采用功能锻炼作为基础治疗。试验组服用补肾强督治偻方加减,对照组服用塞来昔布胶囊,通过24周的临床观察,运用β-CTX、N-MID、P1NP、ASDASCRP、CRP、ESR、BASDAI、BASFI、BASMI、DXA、MRI等指标评价补肾强督治偻综合方案在改善强直性脊柱炎骨代谢及关节功能、影像学方面的临床疗效,探索其骨保护潜能。2.网络药理学研究通过网络药理学方法,探索补肾强督治偻方调节强直性脊柱炎骨代谢作用的潜在可能作用机制。通过在线数据库,搜索强直性脊柱炎疾病靶标、补肾强督治偻方中药靶标,构建疾病、药物PPI蛋白质相互作用关系网络,筛出关键基因,富集关键基因作用通路,从中挑选符合研究强直性脊柱炎骨代谢的最佳信号通路。3.实验研究采用体外实验研究方法,以体外培养SD大鼠成骨细胞为研究对象,采用MTS法观察补肾强督治偻方对于成骨细胞增殖的影响;采用碱性磷酸酶活性检测法检测补肾强督治偻方对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶分泌的影响;采用免疫印迹（WESTERN BLOTING）法探究补肾强督治偻方对于成骨细胞TNF-α、c-Fos、OPG、RANKL、TRAF2、DKK1蛋白表达的影响。补肾强督治偻方药对TNF-α诱导成骨细胞炎症模型的抗凋亡表达影响。结果:1.临床研究补肾强督治偻方案可降低主要疗效指标β-CTX,降低血清骨代谢指标中的N-MID、ALP,炎症指标中的CRP,疾病功能指标中的BASMI,改善胸廓活动度,影像学指标中的髋关节BMD、腰椎BMD,左股骨颈BR、左股骨粗隆间BR、左股骨干BR、骶髂关节水肿情况（SPARCC评分）,患者自身疾病评价中的PGA评分,生活质量评价中的ASQoL评分、SDS评分,治疗前后自身对照,差异无统计学意义（P>0.05）;可升高血清骨代谢指标中的P1NP,治疗前后自身对照,差异无统计学意义（P>0.05）;对疾病功能指标中的BASFI无改善作用（P>0.05）。补肾强督治偻方案能改善强直性脊柱炎的疾病活动度ASDASCRP、疾病功能指标中的BASDAI,炎症指标中的ESR,患者自身疾病评价中的VAS评分,生活质量评价中的中医症候积分、SF-36等指标,治疗前后自身对照,差异均具有统计学意义（P<0.05）。西医综合方案可降低主要疗效指标β-CTX,血清骨代谢指标中的N-MID、P1NP,ALP,疾病功能指标中的BASFI、BASMI,改善胸廓活动度,影像学指标中的腰椎BMD、左股骨颈BR,生活质量评价中的SF-36、SDS、中医症候积分,治疗前后自身对照,差异无统计学意义（P>0.05）;对炎症指标CRP、影像学指标SPARCC评分无改善作用（P>0.05）。西医综合方案可改善疾病活动度ASDASCRP,疾病功能指标中的BASDAI,炎症指标中的ESR,患者自身疾病评价中的PGA、VAS评分,影像学指标中的左股骨颈粗隆间BR、左股骨干BR,生活质量评价中的ASQoL评分,治疗前后自身对照,差异具有统计学意义（P<0.05）。所有的指标,试验组与对照组两组间比较均无显著性差异（P>0.05）。2.网络药理学借助网络药理学方法,初步挖掘、分析补肾强督治偻复方与强直性脊柱炎的潜在靶蛋白可能相关性。发现补肾强督治偻复方治疗AS的生物学作用主要和调节炎症导致相关病理改变有正相关;AS-BSQD交集靶蛋白的作用网络主要是肿瘤坏死因子信号通路、雌激素信号通路、卵巢类固醇生成信号通路、T细胞受体信号通路、破骨细胞分化通路、类风湿性关节炎信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、NF-kappa B信号通路等。筛查AS-BSQD交集靶蛋白的关键基因,得出23个关键基因,发现关键基因作用通路主要集中于免疫炎症信号通路、激素信号通路、癌症信号通路、细胞因子信号通路等。与骨代谢直接相关的通路包括破骨细胞分化通路、Wnt signaling pathway、类风湿性关节炎信号通路、NF-kappa B信号通路等。3.实验研究补肾强督治偻复方对大鼠成骨细胞增殖具有促进作用,72小时,低浓度组（12.5ng/ml）对大鼠成骨细胞增殖率可达1.85±0.18（P<0.01）。补肾强督治偻复方对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶的分泌有促进作用,可于加药培养第9天时达最高峰,第14天时较阳性对照组增长,差异有统计学意义（P<0.01~<0.001）。补肾强督治偻方复方低（12.5、25、50ng/ml）、中剂量（100ng/ml）组的OPG/RANKL比值与阳性对照组相比上升,差异具有统计学意义（P<0.05~<0.001）。补肾强督治偻方低、中及高剂量组与塞来昔布阳性对照组相比,TRAF2蛋白表达明显下降（P<0.05～0.001）。补肾强督治偻方低、中、高剂量组与阳性对照组相比,c-Fos蛋白表达明显下降（P均<0.001）。补肾强督治偻方高剂量组（800ng/ml）与阳性对照组相比,DKK1蛋白表达上调（P<0.01）,低剂量组（50ng/ml）与阳性对照组相比,DKK1蛋白表达下降（P<0.05）;补肾强督治偻复方可降低成骨细胞炎症模型凋亡率,其中低剂量组（50ng/ml）的凋亡率较阳性对照组下降,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:1.中医补肾强督治偻综合方案能改善肾虚督寒型强直性脊柱炎骨代谢,改善炎症,改善疾病功能指标、骶髂关节水肿情况、患者生活质量及中医症候积分,具有一定的骨保护潜能,安全性较好。2.网络药理学研究结果提示:补肾强督治偻复方可能通过炎症、激素、破骨细胞代谢及免疫因子等信号通路作用于AS。与骨代谢直接相关的通路包括破骨细胞分化通路、Wnt signaling pathway、类风湿性关节炎信号通路、NF-kappa B信号通路等。3.不同浓度剂量的补肾强督治偻复方通过破骨细胞通路及Wnt信号转导通路作用于AS,既可以对AS的骨破坏起到抑制的作用,同时也有可能同时在分子水平上抑制成骨细胞过度分化,避免局部异位骨化。