灰兜巴多糖的提取纯化及其抑制α-糖苷酶活性研究

近年来，有关糖尿病的研究一直是国内外学者研究的热点和重点。由于目前市售的药物对糖尿病治疗作用有限，且大多为口服或注射降糖类西药，长期使用有一定的副作用。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制α-葡萄糖苷酶和双糖酶等与底物的结合，减缓多糖的吸收，从而达到降低血糖的目的，对Ⅱ型糖尿病患者尤其有效。从传统中医学考虑，提取天然植物或中药中有效成分，寻找一种安全、高效且无毒副作用的α-糖苷酶抑制剂，对于糖尿病的治疗和研究具有重要意义。本论文选用四川地区治疗糖尿病效果较好的灰兜巴为原料，探讨了灰兜巴中有效的α-糖苷酶抑制剂——灰兜巴多糖的提取和纯化工艺，研究了其体外抑制α-糖苷酶活性，以及对多糖的结构和分子量进行分析测定，为灰兜巴多糖的开发应用提供了实验基础和技术支撑。 本论文的主要内容及结果如下： 1、采用水提醇沉法研究了灰兜巴多糖的提取工艺，考察提取时间、提取温度和料液比对灰兜巴多糖提取量的影响；在单因素实验基础上，采用响应面法优化灰兜巴多糖的提取工艺，得到最佳提取条件为提取温度93.7oC、提取时间3.5h、料液比1：28.5，灰兜巴多糖的提取量达到22.90mg（/5g）。提取次数为2次。醇沉工艺研究结果表明，醇沉时间选择12h，乙醇醇沉浓度为80%时，多糖醇沉的效果较好。 2、采用活性炭脱色，Sevage法脱蛋白对醇沉干燥后的多糖进行研究。结果表明，萃取次数为3次时，蛋白脱除效果较好，并且多糖保留率能达到90%。采用DEAE-52纤维素柱对灰兜巴多糖分离纯化后，得到三种组分多糖，分别为HDBP1、HDBP2和HDBP3。采用葡聚糖G-100凝胶柱纯化灰兜巴多糖HDBP2和HDBP3时，HDBP2有5个吸收峰，说明HDBP2中含有多种多糖；HDBP3有1个单一对称吸收峰，含有一种多糖，为纯品多糖。 3、对HDBP1、HDBP2和HDBP3组分红外测定表明，HDBP1、HDBP2和HDBP3都具有明显的多糖特征吸收峰，为糖类化合物。紫外光谱分析表明3种多糖组分中蛋白和核酸均已脱除。GPC法得到HDBP1、HDBP2和HDBP3的分子量，HDBP1重均分子量为152895Da，HDBP2有3个峰，说明HDBP2不是均一组分，其重均分子量为93953Da，HDBP3有1个单一的相对对称峰，但峰形较宽，其多糖分子量分布为86749Da。 4、对HDBP1、HDBP2和HDBP3组分进行抑制α-葡萄糖苷酶活性测定实验。结果表明，HDBP1没有抑制作用，HDBP2和HDBP3具有较好的抑制作用。HDBP2和HDBP3的IC50浓度分别为0.017mg/mL和0.0075mg/mL，而阳性对照阿卡波糖的IC50值为0.092mg/mL。表明HDBP2和HDBP3对α-葡萄糖苷酶的抑制效果均比阿卡波糖的抑制效果好，且HDBP3的抑制作用比HDBP2的抑制作用更强。 5、HDBP3多糖单糖组成分析结果表明L-鼠李糖：D-岩藻糖：L-阿拉伯糖：D-木糖：D-甘露糖：D-葡萄糖：D-半乳糖的摩尔比为2.33：1.58：1.00：1.37：4.86：4.00：7.30。高碘酸氧化后，高碘酸的消耗量为0.3339mmol，甲酸的总生成量为0.0701mmol。HDBP3多糖中1→、1→6糖苷键约占多糖连接键的37.39%，占可氧化糖苷键的41.99%。Smith降解后，产物中含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。降解产物中没有岩藻糖、阿拉伯糖和木糖，说明岩藻糖、阿拉伯糖和木糖都是以可氧化的键型存在，如1→、1→6、1→4或1→4，6连接。而鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖以不被氧化的1→3、1→2，3、1→2，4、1→3，4、1→3，6以及1→2，3，4键型存在。