葡萄酒MLF优良乳酸菌的筛选鉴定与特性研究

苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation，MLF)是葡萄酒酿造过程中非常重要的发酵过程，通常称为二次发酵，其对酿造优质红葡萄酒来说尤其重要。葡萄酒是否能够顺利启动MLF并最终完成，直接受到发酵菌种及其所处环境的影响。而发酵环境中酒精度、SO2浓度、pH值及温度能够直接影响乳酸菌生长，从而影响葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵。 本文从自然发酵的葡萄酒中分离筛选出产乳酸能力较强的14株MLF乳酸菌，并以多数酒厂用菌L450作为对照菌株，进一步筛选出能够耐受高酒精度、高SO2浓度、低酸、低温优良MLF乳酸菌。在保证发酵性能的基础上，对优良菌株进行了生理生化及16S rDNA分子鉴定，系统地研究了优良菌株的最适生长温度、最适生长pH值及生长曲线。本研究旨在为葡萄酒的酿造及乳酸果汁的发酵提供优良新菌株，并为乳酸菌的商业化应用提供理论基础与技术支持。具体研究内容如下： 实验室模拟酒厂环境进行葡萄酒自然发酵，利用纸层析技术判定葡萄酒MLF的启动时间，取已启动MLF的葡萄酒样，进行分离培养。通过对比不同培养基的分离效果，添加了山梨酸的ATB培养基的分离效果优于MRS+CaCO3和MRS+制霉菌素培养基的分离效果。其中山梨酸在ATB培养基的添加量为1.5g/L，能有效抑制酵母菌、霉菌和部分好氧细菌的生长。对比常规的乳酸菌分离培养基，ATB+山梨酸培养基显著的抑制了真菌及多数杂菌的干扰，同时采取厌氧培养，使得分离效果更为高效和有针对性。 以自然发酵的葡萄酒样为菌源，以活菌数为考察指标，以酒厂生产所用菌株L450为对照，筛选出能够在13%酒精度、130mg/L的SO2浓度、pH值3.0和温度为17℃的条件下正常生长，并且生长状况良好的乳酸菌，最后确定了综合耐受能力最强的菌株G23和L42为高耐受性优良MLF乳酸菌。经生理生化及16S rDNA分子鉴定，确定其均为植物乳杆菌，分别命名为植物乳杆菌G23和L42。高耐受性植物乳杆菌G23和L42的选育，使常规乳酸菌耐受酒精、SO2浓度、酸度、温度能力低下的技术瓶颈得到了有效突破，解决了在低SO2浓度和高温下进行MLF而导致的葡萄酒酒褐变和杂菌繁殖的技术难题。 采用玫瑰香和美乐两种葡萄进行发酵，以未加菌株进行自然发酵的葡萄酒为参照，以MLF启动时间、葡萄酒酸度、色度、发酵香、口感与品评得分为研究指标，得出以下结论：优良菌株G23、L42能够缩短MLF的启动时间、降低葡萄酒的酸度、较小程度的降低葡萄酒的色度值，并且发酵香浓郁、无酸涩口感，葡萄酒综合品评得分较高，说明菌株G23与L42具有良好的葡萄酒发酵特性，能够保证高耐受性菌株的果酒发酵品质，为植物乳杆菌G23与L42投入生产和广泛应用创造了先决条件。 通过测定植物乳杆菌G23与L42在不同温度和不同pH值条件下的活菌数，确定了G23与L42的最适生长温度和最适生长pH值。同时测定了植物乳杆菌G23与L42在0～48h内的OD值和pH值变化，绘制菌株生长曲线。结果表明，植物乳杆菌G23与L42的适宜生长温度为37℃，最适pH为6.0，其细胞收获的最佳时期为适宜条件下培养15～18h。