目的本课题旨在探讨栀子炮制前后化学成分及其肝肾毒性的变化,明确栀子炮制是否具有减轻肝肾毒性的作用,并通过化学成分与肝肾毒性的关联分析明确炮制减毒的物质基础,为栀子不同炮制品的合理使用及质量标准的建立提供科学依据。方法1.生栀子采用2015年版《中国药典》、2010年版《湖南地方炮制规范》和1988年版《全国中药炮制规范》各炮制三批炒栀子（CZ1-CZ3）、焦栀子（JZ1-JZ3）、栀子炭（TZ1-TZ3）和姜栀子（JGZ1-JGZ3）药材。使用超高效液相色谱仪对生栀子（SZ1）、炒栀子（CZ1-CZ3）、焦栀子（JZ1-JZ3）、栀子炭（TZ1-TZ3）和姜栀子（JGZ1-JGZ3）药材中的6种主要化学成分进行含量测定,综合分析栀子炮制前后6种主要化学成分的变化规律。2.正常SD大鼠灌胃给予7.5 g·kg-1剂量的生栀子（SZ1）、姜栀子（JGZ1-JGZ3）、炒栀子（CZ1-CZ3）、焦栀子（JZ1-JZ3）、栀子炭（TZ1-TZ3）水提液,连续给药3 d后,检测血清ALT、AST、TBIL、CREA、BUN指标的水平,计算肝脏和肾脏指数,并对肝脏和肾脏进行组织病理检查。同时利用免疫组化的检测手段初步探讨栀子不同炮制品对肝组织中NLRP3蛋白表达的影响,同时检测血清中IL-18和IL-1β指标的水平。3.利用多元统计分析方法（聚类分析CA、主成分分析PCA和偏最小二乘法分析PLS）,分别将栀子炮制前后的肝肾毒性指标与6种化学成分含量进行聚类分析和主成分分析,然后将栀子炮制前后的肝肾毒性指标+6种化学成分含量进行聚类分析、主成分分析和偏最小二乘法分析,了解栀子不同炮制品种与6种化学成分含量及肝肾毒性之间的关系,明确6种化学成分与肝肾毒性指标之间的关系。结果1.从总体来看,栀子炮制前后6种化学成分的总量变化趋势为生栀子﹥姜栀子﹥炒栀子﹥焦栀子﹥栀子炭。栀子苷含量的变化趋势为生栀子﹥炒栀子﹥姜栀子﹥焦栀子﹥栀子炭;西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ含量的变化趋势为生栀子﹥姜栀子﹥炒栀子﹥焦栀子﹥栀子炭;京尼平龙胆双糖苷含量的变化趋势为姜栀子﹥生栀子﹥焦栀子﹥炒栀子﹥栀子炭;去乙酰车叶草酸甲酯含量的变化趋势为炒栀子﹥姜栀子﹥焦栀子﹥生栀子﹥栀子炭（含量为0）;栀子苷酸含量的变化趋势为焦栀子﹥栀子炭﹥生栀子﹥炒栀子﹥姜栀子。栀子炮制前后6种化学成分表现出不同的变化趋势,但6种化学成分总含量是下降的。2.正常大鼠灌胃给予相同剂量(7.5 g·kg-1)的栀子不同炮制品水提液3 d后,与空白组相比,生栀组ALT、AST和TBIL均显著性升高（P<0.01）;与生栀组相比,其他各给药组的ALT、AST均显著性降低（P<0.01或P<0.05）,姜栀组、焦栀组和炭栀组的TBIL均显著性降低（P<0.01）。栀子不同炮制品对正常大鼠造成不同程度的肝损伤,顺序为生栀组﹥炒栀组﹥姜栀组﹥焦栀组﹥炭栀组,其中生栀组肝损伤最严重,炭栀组肝损伤最轻。与空白组相比,生栀组CREA、BUN指标均显著性升高（P<0.01）;与生栀组相比,焦栀组和炭栀组的CREA、BUN指标均显著性降低（P<0.01）,且姜栀组的BUN指标明显降低（P<0.05）。栀子不同炮制品对正常大鼠造成不同程度的肾损伤,顺序为生栀组﹥炒栀组﹥姜栀组﹥焦栀组﹥炭栀组,生栀组肾损伤最严重,而炭栀组肾损伤最轻。与空白组相比,生栀组、炒栀组、姜栀组、焦栀组、炭栀组的IL-18指标均有所升高,但各组与空白组相比均无显著性差异（P﹥0.05）;与生栀组相比,其他各组的IL-18指标均无显著性差异（P﹥0.05）。与空白组相比,生栀组、姜栀组、焦栀组、炭栀组的IL-1β指标均略微升高,但各组与空白组相比均无显著性差异（P﹥0.05）;与生栀组相比,炒栀组的IL-1β指标略低于生栀组,其他各给药组与生栀组相比均无显著性差异（P﹥0.05）。与空白组相比,栀子不同炮制品给药组肝组织中NLRP3蛋白表达的阳性率均略微升高,但均无显著性差异（P﹥0.05）;与生栀组相比,焦栀组和炭栀组肝组织中NLRP3蛋白表达的阳性率略微降低,但无显著性差异（P﹥0.05）。3.通过聚类分析的方法,13个栀子不同炮制品以6种（栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ）化学成分含量为研究对象,只能区分生栀子和栀子炭。以肝肾毒性指标（ALT、AST、TBIL、BUN、CREA）或6种化学成分含量+肝肾毒性指标为研究对象,生栀子、炒栀子、姜栀子、焦栀子和栀子炭都可以明确的区分。通过主成分分析的方法,13个栀子不同炮制品以6种（栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ）化学成分含量或肝肾毒性指标为研究对象,只能区分焦栀子和栀子炭。以6种化学成分含量+肝肾毒性指标为研究对象,能很好的将生栀子、炒栀子、姜栀子、焦栀子和炭栀子各品种辨别区分。通过偏最小二乘法分析的方法,建立的ALT、AST、TBIL、CREA和BUN指标的回归模型质量良好。栀子炮制前后6种化学成分对肝肾毒性的贡献率,VIP值的顺序为栀子苷﹥西红花苷Ⅰ﹥京尼平龙胆双糖苷﹥西红花苷Ⅱ﹥去乙酰车叶草酸甲酯﹥栀子苷酸,且栀子苷和西红花苷Ⅰ的VIP值均大于0.8,说明栀子苷对肝肾毒性的贡献率最大,其次是西红花苷Ⅰ。结论1.栀子炮制前后各化学成分的含量、总量和组成发生了较大的变化,此与炮制时间和炮制条件的强烈程度有关。随着炮制时间的延长和炮制剧烈程度的加深,栀子炮制后栀子苷、西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的含量不同程度的降低,但是姜栀子中的京尼平龙胆双糖苷,炒栀子、姜栀子和焦栀子中的去乙酰车叶草酸甲酯以及焦栀子和栀子炭中的栀子苷酸的含量均较生栀子含量升高。2.7.5 g·kg-1剂量（折合人用药量75 g）的生栀子、姜栀子、炒栀子、焦栀子、栀子炭对正常大鼠造成不同程度的肝、肾损伤（生栀子﹥炒栀子﹥姜栀子﹥焦栀子﹥炭栀子）,并且栀子炮制之后肝肾毒性不同程度的减轻。3.基于NLRP3通路初步探讨栀子不同炮制品对正常大鼠肝毒性的作用机制研究表明本次实验条件下利用免疫组化法检测各组肝组织中NLRP3蛋白的表达无显著性变化。4.栀子不同炮制品以肝、肾毒性指标+6种化学成分含量分别进行聚类分析和主成分分析,栀子不同炮制品种均可以完全区分开。5.偏最小二乘法分析指出栀子苷和西红花苷Ⅰ对肝肾毒性的贡献率最大,初步推测栀子苷和西红花苷Ⅰ是栀子不同炮制品肝肾毒性的物质基础,可能是栀子苷和西红花苷Ⅰ的协同作用导致正常大鼠的肝肾损伤。
