关节Ⅰ号方对大鼠膝关节骨性关节炎的疗效探讨及对关节软骨组织中MMP-3、MMP-13、TIMP-1表达影响的实验研究

目的:探讨关节Ⅰ号方对大鼠膝骨性关节炎模型的疗效及对关节软骨组织中MMP-3、MMP-13和TIMP-1表达的影响变化;方法:将54只SD大鼠随机抽出9只作为正常组,其余45只均取右后膝关节参照Hulth法造模,造模结束随机处死6只大鼠,检测造模成功后,将KOA模型大鼠再次随机分为5组,分别为模型组、关节Ⅰ号方低、中、高剂量组及阳性对照组,每组8只。依照实验设计进行药物干预治疗,治疗期间观察记录各组动物造模关节局部表现及实验前后动物行为等变化情况。给药6周后,采用脱颈法处死取材并进行相关因子检测:(1)软骨表面的肉眼观察及评分:大鼠处死后,切开各组大鼠的右后膝关节,请三名经过培训的人员遵循双盲原则进行肉眼观察关节软骨一般表现及变化,并参照文献标准[64-65]进行肉眼评分;(2)取软骨组织制作光学显微镜切片,在光镜下观察软骨组织的病理学变化,并按照Mankin’s软骨组织评分对各组大鼠软骨组织的病理变化进行评分;(3)取造模关节软骨组织制作切片,采用免疫组化法检测分析MMP-3、MMP-13、TIMP-1在软骨组织中的表达情况;(4)采用qRT-PCR法检测分析关节软骨细胞中MMP-3、MMP-13、TIMP-1基因相对表达量的变化情况;结果:(1)造模前、后及给药后造模关节局部表现的变化情况:分组造模前所有大鼠右后膝关节活动及外形正常,造模成功时除正常组外其余大鼠均有程度相差不大的右后膝关节骨性膨大、内翻畸形、大鼠跛行、造模关节活动度差等KOA样变,给药结束时正常组大鼠右后膝关节与分组前比较无明显变化,行药物干预治疗的各组大鼠右后膝关节均有不同程度的KOA样变,但是均较模型组KOA样变程度轻。(2)肉眼评分结果显示:模型组及其他各治疗组大鼠软骨的肉眼评分均较正常组增高,差异有统计学意义(P<0.05),关节Ⅰ号方低、中、高剂量组及阳性对照组肉眼评分均较模型组降低,差异有统计学意义(P<0.05),关节I号方中、高剂量组及阳性对照组肉眼评分较关节Ⅰ号方低剂量组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)各组Mankin’s评分结果显示:模型组及药物干预的各组Mankin’s评分均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05),关节Ⅰ号方低、中、高剂量组及阳性对照组Mankin’s评分相对于模型组均降低,差异有统计学意义(P<0.05),关节Ⅰ号方中、高剂量组及阳性对照组Mankin’s评分均低于关节Ⅰ号方低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)免疫组化法检测结果显示:正常组各大鼠右后膝关节均有少许MMP-3、MMP-13、TIMP-1阳性表达;模型组及各治疗组MMP-3、MMP-13、TIMP-1表达量均较正常组升高,差异有统计学意义(P<0.05);关节Ⅰ号方低、中、高剂量组及阳性对照组MMP-3、MMP-13表达量较模型组降低,差异有统计学意义(P<0.05),TIMP-1表达量较模型组升高,差异有统计学意义(P<0.05);关节Ⅰ号方中、高剂量组及阳性对照组MMP-3、MMP-13表达量较关节Ⅰ号方低组均降低,差异有统计学意义(P<0.05),TIMP-1表达量较关节Ⅰ号方低组均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)qRT-PCR检测结果显示:模型组MMP-3、MMP-13基因表达量较正常组增加,差异有统计学意义(P<0.05);关节Ⅰ号方低、中、高剂量组及阳性对照组MMP-3、MMP-13基因表达量较模型组降低,差异有统计学意义(P<0.05)、TIMP-1基因表达量较模型组升高,差异有统计学意义(P<0.05);关节Ⅰ号方中、高剂量组及阳性对照组MMP-3、MMP-13基因表达量较关节Ⅰ号方低剂量组降低,差异有统计学意义(P<0.05),TIMP-1基因表达量较关节Ⅰ号方低剂量组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)模型组及其他药物干预组中MMP-3、MMP-13、TIMP-1表达情况较正常组有较明显改变,证明MMP-3、MMP-13、TIMP-1与KOA病变过程密切相关;(2)关节Ⅰ号方能在一定程度上控制大鼠膝关节骨性关节炎的病情发展,延缓病灶处软骨组织的退变,对KOA的治疗效果明确;(3)关节Ⅰ号方在防治大鼠KOA的病情发展、延缓软骨组织退变的机制之一为:下调关节软骨细胞中MMP-3、MMP-13的表达、促进TIMP-1的表达;(4)阳性对照组关节软骨组织形态学变化及相关细胞因子变化与关节Ⅰ号方中、高剂量组相比较,差异无统计学意义(P>0.05),提示关节Ⅰ号方中、高剂量对大鼠KOA的治疗效果与盐酸氨基葡萄糖相当;