促红细胞生成素对新生大鼠缺氧缺血性脑病保护作用的研究

研究背景缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是新生儿死亡和婴幼儿神经系统功能障碍的主要原因。目前对HIE急性期的治疗强调完善的支持疗法和积极对症处理,挽救了大多数患儿的生命,但相应的后遗症如脑性瘫痪、癫痫、智力低下、学习困难、视听障碍等发生率明显提高,且恢复并不理想,所以探求临床上安全、有效的治疗方法是目前研究的热点。近年来人们越来越关注细胞因子在缺氧缺血性脑病中的作用。有些细胞因子如白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等与HIE的脑损伤有关,而有些细胞因子如转化生长因子-p1(TGF-β1)与HIE的脑修复有关。 重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin, rhEPO)是一种含唾液酸的酸性糖蛋白,可以促进造血祖细胞的增殖与分化。近年来越来越多的研究显示rhEPO可以通过多种机制发挥神经保护作用,且人们对rhEPO与IL-1、IL-6、TNF-α等在HIE中起损害作用的细胞因子的关系进行了相关研究,而对rhEPO与TGF-β1在新生儿及婴幼儿HIE中的关系尚未见相关报道,本实验观察了rhEPO对HIE的保护作用并研究了其对TGF-β1的影响。 目的选择7日龄新生SD大鼠,通过缺氧缺血建立HIE动物模型,治疗组给予腹腔注射重组人促红细胞生成素(rhEPO),观察缺氧缺血后以及经rhEPO治疗后大鼠脑组织的病理改变、神经细胞凋亡情况以及后期大鼠学习记忆能力的变化,了解rhEPO的神经保护作用,并观察缺氧缺血后脑组织中TGF-β1的表达变化情况以及rhEPO对TGF-β1表达的影响,探讨rhEPO对新生大鼠HIE保护作用的可能机制,为临床治疗缺氧缺血性脑病提供有力的理论依据。 方法7日龄新生SD大鼠220只,随机分为假手术组(55只)、模型组(55只)、小剂量rhEPO：55只)组和大剂量rhEPO组(55只)。假手术组大鼠仅对其左侧颈总动脉进行分离,不予结扎及低氧处理；模型组、小剂量和大剂量rhEPO组大鼠均对其左侧颈总动脉进行双重结扎,缺血后置于原母鼠笼中恢复2h,然后置于2000ml常温常压低氧仓内,以2L/min的速度输入含8%氧气和92%氮气的混合气体,持续2h,建立HIE的动物模型,小剂量rhEPO组在缺氧后即刻腹腔注射1000IU/Kg的rhEPO,大剂量rhEPO组在缺氧后即刻腹腔注射5000IU/Kg的rhEPO,均稀释到0.5ml。每组大鼠在模型制备后6h、24h、72h、7d分别测量体重。每组大鼠于造模后72h各处死1只,其脑组织行TTC染色；然后每组每个时间点随机处死6只大鼠,取其脑组织制作石蜡切片,用以进行脑组织常规病理观察、Tunel法检测脑组织的细胞凋亡情况以及用免疫组织化学方法检测脑组织TGF-β1蛋白的表达变化；每组每个时间点再各随机处死6只大鼠,取其脑组织的左侧皮层及海马置于液氮中保存备用,用Western-blot方法检测缺氧后大脑皮层和海马的TGF-β1蛋白的表达情况；最后对每组6只28天大鼠,进行简化Morris水迷宫测试观察其学习记忆能力。SPSS16.0进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。 结果1.模型组、小剂量rhEPO及大剂量rhEPO组大鼠在缺氧过程中出现了行为异常,假手术组大鼠无行为改变；脑组织TTC染色显示,模型组、小剂量及大剂量rhEPO组大鼠损伤侧脑组织呈现白色,为脑缺氧缺血梗死表现,假手术组脑组织无梗死表现；与假手术组比较,模型组、小剂量及大剂量rhEPO组大鼠体重在造模后24h、72h、7d增长较慢(P<0.05),各时间点脑组织细胞凋亡数目百分比均明显偏高(P<0.05),损伤侧脑组织病理改变严重,水迷宫测试平均逃逸潜伏期均延长(P<0.05),差异均有统计学意义。 2.大剂量与小剂量rhEPO治疗组大鼠各时间点的体重较模型组同时间点体重增长快(P<0.05),脑组织细胞凋亡数目百分比较模型组明显减低(P<0.05),脑组织病理改变较模型组改变轻,大剂量rhEPO组大鼠水迷宫测试平均逃逸潜伏期较模型组明显缩短(P<0.05),差异均有统计学意义,小剂量rhEPO组平均逃逸潜伏期较模型组无明显变化(P>0.05),差异无统计学意义；大剂量rhEPO治疗组大鼠与小剂量rhEPO治疗组大鼠比较,各时间点体重增长较快(P<0.05),脑组织细胞凋亡数目百分比较低(P<0.05),脑组织病理改变较轻,平均逃逸潜伏时间明显缩短(P<0.05),差异均有统计学意义。 3.免疫组织化学染色显示TGF-β1主要在脑缺氧缺血损伤侧的皮层和海马表达,主要表达于缺血半暗带的神经元、胶质细胞及血管内皮细胞的胞浆,免疫组织化学与Western-blot半定量分析显示假手术组仅有微量表达,各时间点变化无统计学差异,模型组、小剂量及大剂量rhEPO组TGF-β1阳性表达于6h出现,24h表达增多,胞浆着色加深,颗粒增粗,72h表达达到峰值,7d时阳性细胞表达较前减少,整个表达过程呈先上升后下降趋势,高峰在72h,与假手术组同时间点相比(P<0.05)差异有统计学意义；大剂量及小剂量rhEPO治疗组各时间点TGF-β1蛋白表达较模型组明显增高(P<0.05),大剂量rhEPO组各时间点TGF-β1蛋白表达较小剂量rhEPO治疗组高(P<0.05),差异均有统计学意义。 结论1. rhEPO有一定的神经保护作用,且大剂量rhEPO较小剂量rhEPO具有更好的神经保护作用； 2. rhEPO可以上调缺氧缺血后脑组织TGF-β1的表达,rhEPO上调TGF-β1的表达可能是其神经保护的作用机制之一。