京尼平的制备及其在合成栀子蓝色素与诱导结肠癌细胞凋亡方面研究

京尼平是一种环烯醚萜类天然物质,具有丰富的研究应用价值,可通过京尼平苷经β-葡萄糖苷酶水解或微生物直接发酵中药材栀子制得。在食用色素领域,京尼平可与氨基酸聚合反应制得天然蓝色素──栀子蓝色素。在众多天然色素中,栀子蓝色素由于其良好的溶解性、稳定性以及较强的着色能力,成为人们研究的热点。另外,京尼平作为中药材栀子的主要药效成分,其在抗炎、保肝、利胆、降血糖等方面均有显著的疗效。近年来研究发现京尼平在抗肿瘤方面也具有一定的功效,其在非毒性剂量下能有效抑制乳腺癌、肝癌、宫颈癌等癌细胞的增殖、迁移。本文首先对以栀子为原料,采用酶解法制备京尼平的工艺进行了优化,随后对京尼平的相关应用进行了一些探究,主要优化了京尼平与氨基酸聚合反应制备栀子蓝色素的微波合成工艺,并初步探究了京尼平诱导结肠癌细胞凋亡情况。具体开展的研究内容及结果如下:(1)选用超声波法从栀子中提取京尼平苷,并通过单因素和响应面实验得到超声波法提取京尼平苷的较优工艺为:液料比15:1,超声时间22min,乙醇浓度44%,超声温度44℃,提取次数选择1次,此条件下京尼平苷的提取率可达11.78%。进一步通过验证实验发现实验值与响应面模型的预测值之间相对误差仅有3.08%,证明模型拟合程度良好,得到的较优工艺稳定可靠。(2)通过大孔吸附树脂和氧化铝柱层析法实现了京尼平苷粗提物的分离纯化,得到纯度高达95%的京尼平苷精制品,随后对水解京尼平苷制备京尼平的工艺进行优化,优化后得到的工艺条件为:水解液pH=4.5,水解时间2h,水解温度40℃,β-葡萄糖苷酶与京尼平苷质量比16:1时,此条件下京尼平的产率可达92.87%,进一步通过萃取、重结晶得到纯度高达97%的京尼平。(3)利用微波合成技术将京尼平与氨基酸聚合反应制备栀子蓝色素,根据产品呈色以及着色能力筛选出精氨酸作为合成原料,得到优化后的微波合成工艺为:微波温度100℃、精氨酸与京尼平质量比2:1,微波时间20min,此条件下制得的栀子蓝色素色价达87.93。进一步对栀子蓝色素的pH、光、热稳定性进行研究,结果发现栀子蓝色素的呈色受pH影响不大,但其对高温和强光十分敏感,随着温度的升高和光照强度的增强,栀子蓝色素的降解速率逐渐加快。实验还发现在栀子蓝色素光降解和热降解过程中,强酸强碱条件可起到加速降解的作用,最后通过动力学拟合得到栀子蓝色素的光降解和热降解均符合二级降解动力学模型。(4)通过MTT实验,我们发现京尼平能显著抑制HCT116结肠癌细胞的增殖,并且呈现出明显的时间依赖性和浓度依赖性,利用DAPI荧光染色、AnnexinV-FITC/PI双染实验发现京尼平能显著诱导结肠癌细胞凋亡,进一步检测了京尼平干预后细胞内ROS和线粒体膜电位水平,结果表明京尼平诱导的凋亡过程与ROS介导的线粒体凋亡途径相关。