夹脊电针调节细胞自噬促进脊髄损伤修复的实验研究

目的:通过实验研究,明确脊髓损伤后细胞自噬的表达特征,推测夹脊电针促进脊髓损伤修复作用是通过影响自噬进程,抑制细胞凋亡而实现;揭示夹脊电针对脊髓损伤大鼠脊髓组织细胞自噬相关因子的调节机制。方法:本实验采用Allen's改良式重物坠落法,复制大鼠脊髓损伤模型。应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA),干预细胞自噬。将192只健康SD雄性大鼠,体重约200 ±20g,随机分为4组:假手术组、模型组、3-MA+夹脊电针治疗组、夹脊电针治疗组,每组48只,根据造模后时间长短分为4h、1d、3d、7d四个亚组。在脊髓损伤后各时间点进行BBB评分;HE染色观察各组脊髓组织病理学变化;免疫组化染色法观察脊髓组织中Beclin1、LC3阳性细胞数表达情况;透射电镜观察各组脊髓组织超微结构变化;免疫荧光法检测损伤脊髓组织中Beclin1、LC3表达;蛋白质印记法检测脊髓组织Beclin1、LC3、P62、Bcl-2、Bax蛋白表达规律;实时荧光定量PCR法检测脊髓组织Beclin1、LC3、Bcl-2、BaxmRNA表达情况。实验结果:(1)BBB评分:SCI后各时间点与假手术组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组、夹脊电针治疗组BBB评分降低,差异有统计学意义(p<0.01)。SCI后1d、3d、7d,与夹脊电针组比较,模型组BBB评分较低,差异具有统计学意义(p<0.05);3-MA+夹脊电针治疗组评分较低,差异无统计学意义(p>0.05)。(2)HE染色:假手术组脊髓组织接近正常脊髓组织。SCI后4h脊髓组织切片内可见大量的空腔,空腔内存在坏死组织碎片及片状出血。从SCI后3d起,与模型组、3-MA+夹脊电针治疗组比较,夹脊电针治疗组脊髓组织损伤程度得到改善。(3)免疫组织化学法:假手术组中,Beclin1和LC3在细胞中表达较弱,SCI后4h,二者表达升高,主要表现在神经细胞及胶质细胞中,呈黄色及棕黄色染色。Beclin1、LC3的阳性细胞数表达高峰均在SCI后1d,在随后时间点,阳性细胞数逐渐降低。SCI后各时间点,与假手术组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组、夹脊电针治疗组Beclin1阳性细胞数较多,差异具有统计学意义(p<0.01);SCI后4h,与假手术组比较,模型组、夹脊电针治疗组LC3阳性细胞数较多,差异具有统计学意义(p<0.01);3-MA+夹脊电针治疗组LC3阳性表达数增多,差异无统计学意义(p>0.05)。SCI后Id、3d、7d,与假手术组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组、夹脊电针治疗组Beclin1、LC3阳性细胞数较多,差异具有统计学意义(p<0.01);SCI后各时间点,与夹脊电针治疗组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组Beclin1和LC3阳性细胞数较少,差异具有统计学意义(p<0.01)。(4)电镜:SCI后脊髓组织出现胞浆水肿,线粒体肿胀明显,髓鞘变薄、断裂、脱髓鞘样改变严重。SCI后4h,溶酶体数量增多,可见大量空洞形成,出现自噬溶酶体及自噬小体。SCI后1d起,与模型组、3-MA+夹脊电针治疗组比较,夹脊电针治疗组脊髓组织自噬溶酶体及自噬小体数量均增多。至SCI后7d,仍可见到自噬小体,但其数量减少,可见新生髓鞘。(5)免疫荧光:假手术组在各时间点Beclin1和LC3呈均匀低表达,SCI后4h可见组织染色逐渐加深,阳性细胞数明显增加,可持续到SCI后7d。SCI后各时间点与夹脊电针组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组Beclin1及LC3阳性细胞数减少,荧光强度减弱。(6)Western Blot 法:SCI 后各时间点假手术组 Beclin1、LC3、P62、Bcl-2、Bax蛋白表达水平无统计学意义(p>0.05)。SCI后4h,与假手术组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组、夹脊电针治疗组Beclin1及LC3蛋白含量增多,差异具有统计学意义(p<0.01);P62蛋白含量减少,差异具有统计学意义(p<0.01);与夹脊电针治疗组比较,模型组Beclin1蛋白含量较少,差异无统计学意义(p>0.05);LC3蛋白含量较少,差异具有统计学意义(p<0.01);P62蛋白含量较多,差异具有统计学意义(p<0.05)。SCI后Id、3d、7d,与假手术组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组及夹脊电针治疗组Beclin1及LC3蛋白含量增多,差异具有统计学意义(p<0.01);P62蛋白含量减少,差异具有统计学意义(p<0.01)。与夹脊电针治疗组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组Beclin1及LC3蛋白含量较少,差异具有统计学意义(p<0.01);模型组、3-MA+夹脊电针治疗组P62蛋白含量相对较多,差异具有统计学意义(p<0.01)。Beclin1及LC3蛋白含量从SCI后4h开始增多,1d达到高峰后逐渐下降。SCI后各时间点与假手术组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组、夹脊电针治疗组Bcl-2、Bax蛋白含量升高,差异具有统计学意义(p<0.01);与夹脊电针治疗组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组Bcl-2蛋白含量较少,差异具有统计学意义(p<0.05)。从SCI后4h起,Bcl-2蛋白含量逐渐增加,持续到SCI后7d仍未下降。SCI后4h、1d、3d、7d,与夹脊电针治疗组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组Bax蛋白含量增多,差异具有统计学意义(p<0.01)。模型组Bax蛋白含量从SCI后4h开始增多,3d达到高峰后下·降;夹脊电针治疗组Bax蛋白含量在SCI后1d含量最低,随后逐渐上升。(7)实时荧光定量PCR检测:假手术组中Beclin1、LC3、Bcl-2、Bax的mRNA表达量较少,且在各时间点表达量差异无统计学意义(p>0.05)。SCI后4h,与假手术组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组、夹脊电针治疗组BeclinlmRNA表达量增多,差异具有统计学意义(p<0.05);LC3mRNA表达增多,差异有统计学意义(p<0.01);BaxmRNA表达量增多,差异具有统计学意义(p<0.01);3-MA+夹脊电针治疗组与假手术组比较,Bcl-2mRNA含量差异无统计学意义(p>0.05)。与夹脊电针治疗组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组Beclin1、LC3、Bcl-2mRNA表达量较少,BaxmRNA表达增多,差异具有统计学意义(p<0.05)。SCI后1d、3d、7d,与假手术组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组、夹脊电针治疗组Beclin1、LC3、Bcl-2、Bax的mRNA表达量相对较多,差异具有统计学意义(p<0.05);与夹脊电针治疗组比较,模型组、3-MA+夹脊电针治疗组Beclin1、LC3、Bcl-2mRNA表达量相对较少,差异具有统计学意义(p<0.05);BaxmRNA表达量较多,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1.夹脊电针可以改善脊髓损伤大鼠后肢运动功能障碍。2.夹脊电针能够促进脊髓损伤后脊髓组织病理形态学恢复。3.脊髓损伤后Beclin1、LC3阳性细胞数增多,SCI大鼠脊髓组织中Beclin1、LC3蛋白表达量升高,细胞自噬被激活;P62蛋白表达减少,脊髓组织在脊髓损伤后发生自噬流。4.夹脊电针能够促进脊髓损伤后细胞自噬的发生,抑制细胞凋亡。