酵母活性肽制备及其抗氧化活性研究

我国是啤酒生产和消费大国,有丰富的废啤酒酵母资源,但目前尚未得到有效开发与利用。本研究拟以废啤酒酵母为原料,利用其所富含的蛋白质组分,通过生物酶解技术开发具有明确功能活性、高附加值的生物活性短肽。研究中通过对酶解工艺优化及产品功能特性的研究,拟建立一种产业化可行、高得率、高功能活性的酵母活性肽生产工艺;并通过现代分离、分析技术对活性肽组分进行纯化、鉴定,获得高功能活性的肽分子片段及其结构信息,明确酵母活性肽某一特定生物活性的构效关系。 首先,通过对常见商品酶制剂（Alcalase、Neutrase、Protamex、N120、Papin、Flavorzyme）对酵母蛋白水解能力的研究,选取碱性蛋白酶（Alcalase）来制备酵母活性肽,并系统地研究了Alcalase的用量、反应pH值、温度、时间等酶解工艺条件对酵母蛋白水解率的影响,通过正交旋转实验建立了总氮得率及氨基态氮得率与各种影响因素的回归模型,确定了Alcalase酶解制备酵母活性肽的最佳工艺条件,即加酶量361.7U/g（以酵母干基计）,pH值8.7,温度50.8℃,水解时间24h,在此作用条件下,酵母水解物总氮得率为50.17% ,氨基态氮得率为32.80%。 为了进一步提高酵母细胞蛋白质的溶出率,本研究尝试采用超声波、高压均质、生物酶法（β-葡聚糖酶）等几种破壁方法对酵母细胞进行后处理。实验结果表明,高压均质破壁法破壁效果好,样品处理量大,适于工业化生产,在50MPa操作压力下,产品得率可增加至65%以上。 将酶解制备的酵母活性肽进行组分分级。用超滤膜分别截留分子量10K3K,3K1K,<1K的组分,并测定各组分的抗氧化活性,结果证实分子量<1K的组分活性最高,其DPPH清除率为45.40%（1mg/ml）。利用离子交换层析法对分子量<1K的组分进一步纯化。选取SP Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂,采取梯度洗脱法,起始吸附缓冲液为1M醋酸溶液,最终解析缓冲液为1M Nacl溶液。经离子交换色谱分离后,证实抗氧化活性最高的组分是峰33,其DPPH清除率为89.38%（1mg/ml）。 利用体外化学模型对经离子交换层析得到的4个组分进行抗氧化活性比较,结果表明4组分均具有一定的清除羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）、脂质抗氧化的活性,其中峰33的活性均为最高,自由基清除率分别为66.24%（10mg/ml）,58.11%（25mg/ml）,46.27%（50mg/ml）。 抗氧化活性最高的峰33由凝胶过滤色谱（Sephadex G-15）证实为单一峰,又采用液质联用技术（LC-ESI-MS）进行组分鉴定,得到三组图谱峰,经检索数据库（Swiss Protein Database）分析,该高抗氧化性酵母肽是由4～7个氨基酸组成的混合肽,它们的分子量分别为538.28,778.22,570.47,氨基酸序列为Asn-Tyr-Leu-Glu; Asp-Val-Thr-Glu-Thr-Leu-Thr; Gln-Val-Pro-Asn-Leu。