壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒的制备及其评价

漆黄素具有广泛的药理活性,在抗炎、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗血栓和糖尿病肾损伤的治疗等方面具有较好的作用,且来源广泛、价廉易得,对人体的毒副作用小,但是漆黄素存在难溶于水、生物利用度低的缺点,从而限制了其进一步的开发和临床应用。纳米粒制剂可以改善难溶性药物的溶解度,提高药物的物理化学稳定性、生物利用度及靶向性。本研究拟制备壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒,在对其体外释放特性和表征进行研究同时,考察其体外抗肿瘤效果及大鼠体内药代动力学特性,以期提高漆黄素的溶解度、生物利用度以及抗肿瘤效果。本文研究主要分为以下五个部分:第一章综述本章主要针对漆黄素、纳米制剂、聚乳酸纳米粒、壳聚糖进行回顾总结。内容分为五个部分,第一部分主要介绍了漆黄素的结构性质、提取分离方法,并总结了漆黄素的药理活性及其制剂研究进展。第二部分讲述了纳米制剂的优势、纳米制剂的载体材料、纳米粒包封率的测定方法及其体外释放研究方法。第三部分主要介绍聚乳酸纳米粒,介绍了聚乳酸及其在医药领域的应用以及聚乳酸纳米粒的制备方法。第四部分主要概括了壳聚糖的理化特性及其在制剂方面的应用。第五部分介绍本课题的研究目的和主要内容。这些内容为本研究得开展提供了重要参考。第二章漆黄素聚乳酸纳米粒的制备本章采用自乳化溶剂扩散法制备漆黄素纳米粒。首先建立体外漆黄素含量HPLC测定方法,该方法精密度良好,测定结果准确,日间日内精密度考察RSD<2%。随后以包封率为指标,在单因素试验基础上确定因素对应的水平,采用正交实验进行漆黄素聚乳酸纳米粒处方优化,获得最佳处方为:药载比为1:10,O/W比为1:7,F68浓度为0.5%,丙酮与乙醇体积比为3:3。因素影响顺序:药载比>O/W比>泊洛沙姆188浓度>丙酮与乙醇体积比。方差分析结果表明,药载比对包封率具有显著性影响。最后,通过使用马尔文粒径仪测定漆黄素纳米粒的粒径和Zeta电位,超滤离心法测定纳米粒的包封率对最佳处方的漆黄素聚乳酸纳米粒进行表征:平均包封率为90.35%,平均粒径为226.85nm,平均载药量为3.12%,平均Zeta电位为-15.63 m V,且RSD均小于5%,表明由正交试验筛选的最佳处方制备的漆黄素纳米粒具有良好质量和重现性。第三章壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒的制备、表征及其体外释放本章在漆黄素聚乳酸纳米粒的基础上进行壳聚糖修饰,制备壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒,以期提高抗肿瘤效果,减缓漆黄素从纳米粒突释的现象。通过考察壳聚糖含量对纳米粒粒径和电位的影响,确定修饰漆黄素聚乳酸纳米粒的壳聚糖加入量为0.2%。透射电镜观察显示聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒的外观呈现球形,表面圆整光滑,且与漆黄素聚乳酸纳米粒相比,壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒的表面明显有壳聚糖包裹,粒径也随之稍微变大,纳米粒之间无黏连现象,分散性较好,且粒径在200nm左右,分布均匀。傅里叶红外光谱分析结果可知,漆黄素和载体之间可能存在氢键缔合作用;差示扫描量热法测定结果显示,漆黄素是以非晶态形式存在于载体中。以漆黄素平衡溶解度最好的p H6.8的PBS溶液(0.5%Tween)为体外释放介质,采用动态透析法考察纳米粒体外释药特性,结果显示原料药在1 h左右释放约78%,壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒制剂释放约27%,表明与原料药相比,壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒具有显著的缓释效果。第四章壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒体外抗肿瘤活性研究本章以结肠癌HCT116细胞为模型,采用MTT法考察壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒的体外抗肿瘤效果。实验结果显示,200μg/m L的漆黄素原料药作用48h后,细胞抑制率达到68.43%,漆黄素聚乳酸纳米粒对细胞的抑制率为75.18%,而壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒对细胞的抑制率达到81.34%。而且细胞形态显著发生改变,细胞皱缩、显著变小,细胞数量减少。由此可见,与漆黄素原料药和漆黄素聚乳酸纳米粒相比,壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒具有对结肠癌细胞更好的抑制效果。第五章壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒大鼠体内药代动力学研究为考察壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒在大鼠体内的药代动力学特征,本章建立了漆黄素在血浆中的含量HPLC测定体系,标准曲线方程为:A=0.39701C+0.04538,R2=0.9939,表明漆黄素浓度在0.1～10μg/m L范围内与峰面积比(漆黄素和内标峰面积比)呈良好线性关系,日间、日内精密度考察显示RSD均小于10%,符合体内分析测定方法的要求。雄性SD大鼠尾静脉给药后药动学参数显示,壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒制剂将漆黄素的半衰期从1.84 h延长至3.42h,减缓漆黄素在体内的清除速度。原料药在体内的平均滞留时间为4.86±0.16 h,而壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒延长到10.67±1.81 h。原料药的药时曲线下面积为8.31±1.92 hμg/m L,而壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒的药时曲线下面积为19.28±2.15hμg/m L,相对生物利用度为232%,表明本研究制备的壳聚糖修饰漆黄素聚乳酸纳米粒可以有效提高漆黄素在体内的生物利用度,延长体内的滞留时间。