肠道微生物与人体健康密切相关,正常菌群在人体消化、免疫和抗病等方面有着不可取代的作用。成年人肠道菌群主要由肠道菌群定植过程决定,婴儿期是肠道菌群定植的关键时期。在婴儿期,喂养方式是影响肠道菌群定植的重要因素。目前针对母乳喂养和人工喂养婴儿肠道菌群结构的研究结果存在很大的争议,喂养方式对婴儿肠道菌群影响的研究仍为国内外婴儿营养研究的热点。同时已有很多研究表明喂养方式与婴儿腹泻、坏死性小肠结肠炎(NEC)、过敏性等疾病有关系。因此有必要采用高通量测序技术来明确确定母乳喂养和人工喂养婴儿肠道菌群是否存在差异,以更全面的了解不同喂养方式婴儿肠道菌群的构成。进而阐明喂养方式与婴儿健康和疾病的关系。本研究采集了24份1-6个月婴儿粪便标本,分为母乳喂养组(12份),混合喂养组(8份)和人工喂养组(4份)。采用QIAamp DNA stool mini kit试剂盒提取婴儿粪便微生物的总DNA,通过Illumina高通量测序技术对16SrRNA基因的V6可变区进行测序分析。经检测发现婴儿粪便微生物具有较高的多样性,最多可检测到461个物种。不同喂养方式婴儿粪便微生物的多样性不同,人工喂养组和混合喂养组的多样性高于母乳喂养组。基因序列分类显示98.9%以上的序列主要由四个菌门组成：Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria。三种喂养组在门水平分类上均以Firmicutes和Proteobacteria为主要优势菌门。
OTU物种注释选择“科”为最佳分类水平。在科水平上,物种丰度≥1%的科共检测到13个。母乳喂养组以Enterobacteriaceae、Veillonellaceae、Bacteroidaceae为优势菌,其次依次为Bifidobacteriaceae、Streptococcaceae、Lachnospiraceae。而人工喂养组和混合喂养组均主要以Enterobacteriaceae、Streptococcaceae为优势菌,其次混合喂养组还有Bifidobacteriaceae、 Bacteroidaceae、Vibrionaceae、Veillonellaceae、Porphyromonadaceae、Lachnospiraceae。人工喂养组还有Lactobacillaceae、Clostridiaceae、Peptostreptococcaceae、Veillonellaceae、 Lachnospiraceae、Vibrionaceae、Enterococcaceae、Erysipelotrichaceae。主成分分析结果显示造成样品之间差异贡献较大的类群主要有Enterobacteriaceae、Veillonellaceae、Bacteroidaceae以及Bifidobacteriaceae。 Enterobacteriaceae在三组中均为优势菌,但其在人工喂养组婴儿粪便中所占的比例(50.82%)明显高于母乳喂养组(28.66%),混合喂养组为41.44%。母乳喂养组中Veillonellaceae和Bacteroidaceae的相对丰度分别是21.42%和12.82%,明显高于混合组喂养组(3.65%和4.32%)和人工喂养组(3.25%和0.04%)；Bifidobacteriaceae在母乳喂养组婴儿粪便菌群中所占的平均比例仅在8%左右,并非主要优势菌,但高于人工喂养组(1.48%)。人工喂养组婴儿粪便菌群呈多样化,Lactobacillaceae、Clostridiaceae、 Peptostreptococcaceae、Enterococcaceae、Erysipelotrichaceae在菌群所占比例范围均介于2%～6%之间,而在母乳喂养组和混合喂养组中检测到数量很少,分别介于0-3%和0-1%之间。
Beta diversity分析和聚类分析均指出不同喂养组组内样品之间也存在较大差异,为了进一步分析不同采样时期婴儿肠道菌群的动态变化,对所有样品物种丰度统计分析发现,肠道菌群在1-3个月构成较简单,3个月以后开始复杂化,多样性增加。其中混合喂养组在3个月前后肠道菌群结构变化最大,1-3个月内,主要以Enterobacteriaceae和Streptococcaceae为优势菌,与人工喂养组婴儿肠道菌群结构相似；而在4-6个月内,Bacteroidaceae、 Porphyromonadaceae、Bifidobacteriaceae、Lachnospiraceae的数量明显增加,肠道菌群结构与母乳喂养组相似。另外,在1-3个月,混合喂养组和人工喂养组中Enterobacteriaceae、 Streptococcaceae的数量(平均比例分别是44.53%和33.97%、62.19%和20.77%)明显高于母乳喂养组(26.75%、8.09%),而在4～6个月,三组中两种菌所占的平均比例相似。
本文采用高通量测序技术证明了1-6个月不同喂养方式婴儿肠道微生物区系的差异,母乳喂养婴儿肠道中含有较多的Veillonel(?)aceae和Bacteroidaceae,而人工喂养和混合喂养婴儿肠道中趋于Enterobacteriaceae和Streptococcaceae较多。这一研究不仅为今后婴儿肠道菌群的研究提供了理论和技术支持,而且使我们对母乳和人工喂养婴儿肠道菌群结构有了更全面的认识,为喂养方式与婴儿肠道疾病关系的研究提供了重要资源。
