本研究旨在检测硝基呋喃类代谢物的残留,合成了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ),对于呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因三种药物的代谢物(AOZ、SEM、AHD)合成了免疫原并且制备了相应的多克隆抗体。其中针对呋喃妥因代谢物残留建立并优化了间接酶联免疫方法(ic-ELISA),针对呋喃西林代谢物研制了一种快速检测的胶体金免疫层析试纸条。
实验首先合成了呋喃唑酮代谢物AOZ,并用仪器鉴定其纯度,完全适合作为标准品使用。然后针对AOZ、SEM和AHD三种代谢物设计了结构合理的半抗原,进行衍生化合成,并用仪器确定了其最终纯度。使用两种方法使半抗原分别与牛血清蛋白、卵清蛋白偶联合成免疫抗原和包被抗原,并对其进行偶联效果的鉴定。
每种免疫原采用2只新西兰大白兔进行免疫,按照既定免疫程序,监测免疫后抗血清效价。进行了4个多月的反复免疫直到获得满意的抗血清效价,采集全部抗血清并进行纯化,最终经过筛选得到每组中较好的抗血清效价分别为153600,307200和614400,完全符合免疫实验要求,并作为之后的免疫分析抗体。
选择呋喃妥因代谢物AHD的抗体建立了相应的间接竞争ELISA方法,并对包被条件、封闭条件、竞争时间等条件进行了优化测定,并且从灵敏度、特异性和准确性三个方面进行了评估。最终优化后ELISA方法的IC50为3.6 ng/mL,LOD(90%抑制率对应的浓度)为0.085 ng/mL;该抗体不与其结构类似物等有明显交叉反应,特异性良好;通过对猪肉样本添加不同剂量标准品AHD,并对其用苯甲酸进行衍生化处理作为目标检测物,最后检测实际样本回收率和变异系数均达到兽药残留分析要求。
此外,对于呋喃西林代谢物SEM抗体建立了胶体金免疫层析方法并对其进行了优化。首先制备了18 nm的胶体金溶液,标记抗体并且纯化。对重悬液、抗原稀释液等反应溶液进行了筛选比较。对优化后试纸条的性能进行了评测,裸眼检测限达到40 ng/mL,而且对类似物检测时无交叉反应。实验还对试纸条的可靠性做了确认,设置80个标准样本进行测试,并用ELISA方法作了平行实验,结果两种方法的一致率达到98%。
本实验一方面制备了灵敏度高、特异性良好的硝基呋喃代谢物抗体,可供今后免疫检测分析使用,另一方面建立的AHD间接ELISA方法和SEM胶体金免疫层析方法既满足了对硝基呋喃药物的残留检测,也为今后对硝基呋喃类代谢物免疫检测的进一步研究提供了依据。
