β-半乳糖苷酶菌株筛选、酶的分离纯化和性质及酶法合成低聚半乳糖的研究

低聚半乳糖（GOS）是一种重要的功能性糖，其分子由2～10个半乳糖基和1个葡萄糖基组成。由于它可以选择性的促进肠道益生菌增殖，并能够增强机体对钙和其他矿物质的吸收，因此也被称为益生元。低聚半乳糖同时还具有低致龋齿性，低热值以及低甜度值等特点。商品化低聚半乳糖主要是以乳糖为底物经β-半乳糖苷酶酶法合成制得。 β-半乳糖苷酶属于水解酶类，某些还具有一定的转糖基活性，当以水为受体时，它能够催化乳糖水解成为葡萄糖和半乳糖；当以糖基为受体时，它能够催化底物发生转糖基反应生成低聚糖。 本实验室从牛奶厂土壤中筛选出一株高产β-半乳糖苷酶的新菌株Shigella sonnei SK22.001，并运用高效液相色谱技术（HPLC）和液质联用技术（LC/MS）对其与乳糖反应的产物进行了分析。结果表明，该酶反应产物由低聚半乳二糖、低聚半乳三糖、低聚半乳四糖、葡萄糖、半乳糖和未反应乳糖组成。本文首先研究了培养基组分和发酵条件对酶活的影响，通过单因素实验，确定了该菌株培养基的最佳碳源和最佳氮源，即乳糖10g/L、酵母浸膏10g/L、蛋白胨（鱼粉）5g/L。最佳的发酵条件为：发酵温度30oC、发酵培养基起始pH7.0、摇瓶装液量20%（v/v）、摇床转速200r/min和接种量3%（v/v）。在此条件下发酵21h，β-半乳糖苷酶水解酶活为6.02UoNPG/mL发酵液，转糖基酶活为0.51ULac/mL发酵液。 其次，对Shigella sonnei SK22.001所产β-半乳糖苷酶粗酶液依次进行硫酸铵分级沉淀、热处理、Hiprep DEAE-FF16/10离子交换层析和Superdex200凝胶过滤层析，获得了电泳纯的β-半乳糖苷酶。整个纯化过程的纯化倍数为24.31，回收率为9.72%，比酶活为184.24UoNPG/mg。电泳分析表明该β-半乳糖苷酶亚基相对分子量约为120kDa，凝胶过滤色谱测定表明其相对分子量约为365kDa，推断该酶为三倍体蛋白。 再次，本文对纯化后β-半乳糖苷酶的酶学性质进行了研究。结果表明，该酶的水解酶活和转糖基酶活的最适温度分别为50oC和55oC，最适pH分别为6.5和7.0。金属离子Na+和K+对该酶的水解酶活具有一定的抑制作用，但是对转糖基酶活几乎无影响，而Cu2+能使该酶完全失去活性。乳糖水解产物葡萄糖对该酶的水解酶活具有较强的抑制作用，而半乳糖对水解酶活影响较小；半乳糖和葡萄糖均对转糖基酶活具有一定的抑制作用。分别以邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（oNPG）和乳糖为底物，该酶的Km为3.29mmol/L和0.227mol/L，Vmax为4.91μmol·min-1·mg-1和3.42μmol·min-1·mg-1。 最后，在酶学性质的研究基础上，以低聚半乳糖产率为考察指标，进一步研究了酶在催化乳糖反应过程中缓冲溶液、乳糖浓度、加酶量、反应温度和pH对低聚半乳糖产率的影响。实验结果表明，合成低聚半乳糖反应的最佳条件为：pH为7.0，起始乳糖浓度为45%（w/v），以0.1mol/L的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液溶解底物乳糖，反应温度为55oC和加酶量为20UoNPG/g乳糖。在上述反应条件下反应12h，GOS产率达到44.5%。