银杏种仁抑菌蛋白及其抑菌机制研究

以银杏种仁为原料，研究了银杏种仁蛋白的抑菌活性及其抑菌机制，分析了其性质、组成及结构，为天然食品防腐剂的开发及银杏种仁的综合利用提供参考。主要研究结果如下： （1）银杏种仁中主要存在酚酸、多糖及蛋白3种抑菌活性物质。银杏种仁酚酸主要由羟基侧链为C13:0、C15:1、C17:2、C15:0、C17:1的5种组分组成，对E.coli、B.subtilis2种细菌及Penicillium1种真菌的抑菌活性较强，最小抑菌浓度分别为7.5mg/mL、15mg/mL、25mg/mL。银杏种仁多糖（50～80%醇沉级分）为一种含有87.4%多糖和1.03%蛋白的复合糖蛋白，分子量约40kDa，该多糖对B.subtilis有较强的抑菌活性，MIC为50mg/mL，但对真菌几乎无抑菌活性。银杏种仁蛋白（40～80%硫酸铵沉淀级分）对革兰氏阳性及阴性细菌均有抑菌活性，其中对K.peneumoniae的抑菌活性最强，MIC为100mg/mL，同时对Penicillium, T.delbrueckii，A.niger等3种真菌的MIC均为100mg/mL，具有广谱抑菌性。 （2）采用磷酸缓冲液提取银杏种仁蛋白，以蛋白提取率为指标，采用响应面分析法探讨料液比、提取液浓度及提取时间等因素对蛋白提取率的影响，结果表明料液比、提取液浓度及提取时间均对蛋白提取率有极显著影响（P<0.01），且三者间交互作用均对蛋白质的提取率有显著影响（P<0.05），蛋白提取的最佳工艺条件为液料比20mL/g，提取液浓度0.07mol/L，提取时间14h，在此条件下，蛋白质一次提取率为86.58%，结果在可信度分析范围之内。 （3）以K.peneumoniae、S.aureus2种细菌及T.delbrueckii、A.niger2种真菌为供试菌，依次采用硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-Cellulose52阴离子交换柱层析及Sephadex G-75凝胶过滤柱层析对银杏种仁蛋白进行纯化，确定适宜的硫酸铵饱和度为40%～80%，纯化得到1个抑菌活性最强的蛋白峰，命名为GBSP-A。GBSP-A对4种菌的最小抑菌浓度分别为20mg/mL、20mg/mL、20mg/mL及12mg/mL； SDS-PAGE显示该纯化蛋白为单一条带，表观分子量为41.8kDa, Schiff染色结果表明其为糖蛋白，蛋白与糖的比例为70﹕1；Superdex G-75柱层析结果显示GBSP-A呈单一对称峰，高效液相凝胶过滤色谱（HPGPC）检测其分子量为39.316kDa。 （4）对GBSP-A的结构进行了表征，β-消去反应表明该糖蛋白的糖肽键类型为O-糖苷键，红外分析表明其为同时含有α-和β-糖苷键的吡喃糖蛋白化合物，刚果红试验表明其中的糖链不含3股螺旋，LC-MS-MS分析表明该蛋白与银杏中的一种11S结合蛋白（ginkbilobin-2precursor）匹配率很高，共得到10个匹配肽段序列，通过CAMP抗菌肽数据库对该蛋白肽片段进行氨基酸序列比对，发现此蛋白为一种新的抑菌蛋白。 （5）理化性质研究表明，GBSP-A不含淀粉、游离多糖及游离氨基酸，具有蛋白质及多糖典型性反应特点，在220nm及280nm处有紫外吸收峰。该蛋白对pH、热及NaCl盐溶液较为稳定，DSC扫描结果表明其热变性温度为63.7℃。氨基酸组成分析表明，GBSP-A至少含有16种氨基酸，其中天门冬氨酸（Asp，7.269%）含量最高，对蛋白质稳定性有重要影响的疏水性氨基酸含量占总氨基酸的36.2%。 （6）以K.peneumoniae及S.aureus为供试菌，探讨了银杏种仁抑菌蛋白（GBSP-A）对供试菌生长发育的影响，结果表明，GBSP-A能抑制K.peneumoniae（G-）及S.aureus（G+）的生长，使其生长曲线发生改变，异于正常菌体的繁殖趋势；扫描电镜及透射电镜观察显示GBSP-A处理后的供试菌菌体细胞壁膜融解、消失，细胞质泄漏，并最终崩解，导致菌体死亡；对细胞膜渗透性的研究表明，GBSP-A处理后，供试菌菌悬液的电导率升高，Na+及其它大分子物质大量泄漏，胞外β-半乳糖苷酶活性升高。抑菌蛋白还能增加菌体细胞表面的电负性及疏水性，从而使其更易絮凝、沉淀，并最终死亡。 （7）以K.peneumoniae及S.aureus为供试菌，研究了银杏种仁抑菌蛋白对细菌呼吸代谢的抑制途径以及对蛋白质、DNA、ATP含量和几种相关酶活性的影响。结果表明，抑菌蛋白对供试菌的呼吸代谢会产生一定的抑制作用，但并不是通过TCA、EMP及HMP中的任何代谢途径来发挥作用；抑菌蛋白会抑制菌体内蛋白质、DNA的合成及ATP的产生，但并不能抑制菌体内任何一种蛋白质的表达，也不能使DNA发生断裂；抑菌蛋白会使菌体内ATP酶、β-半乳糖苷酶及碱性磷酸酶的产生量降低，进而影响到菌体正常的生理代谢。同时，抑菌蛋白浓度对菌体代谢的抑制作用没有显著量效关系。