黄连水提物对痢疾杆菌的抑菌机制研究

随着抗菌药物的广泛使用,出现了诸如毒性反应、二重感染、细菌耐药性等一系列问题,尤其是细菌耐药性的传播与蔓延,将导致多重耐药菌感染面临无药可医的严重局面。研究表明,有些中药具有良好的抑菌作用,而且毒副作用小,不易产生耐药性,特别是有的中药还能够清除耐药菌的耐药质粒、降低其耐药性。药理学研究表明,黄连具有广谱抗菌、抗病毒作用,其临床疗效已获得广泛认可,但其抑菌机制尚不明确。本研究从分子水平上对黄连抑制痢疾杆菌的抑菌机制进行了探讨,以期为黄连在临床抗感染方面的应用提供理论指导。试验以黄连水提物为试验药物,以痢疾杆菌为供试菌。首先采用倍半稀释法和吸光光度法考察了黄连对痢疾杆菌的最小抑菌浓度（MIC）及对菌体生长曲线的影响;然后选择适宜的黄连浓度和培养时间,采用分光光度法测定了黄连对痢疾杆菌细胞膜通透性、能量代谢活力及细胞壁的影响;通过凝胶阻滞实验测定了黄连对痢疾杆菌基因组DNA及蛋白合成的影响;荧光定量PCR法检测了黄连对痢疾杆菌四种毒力因子（ipaH、dsbA、sodB和iutA）表达的影响;流式细胞仪DCFH-DA染色法检测了黄连对痢疾杆菌菌体内活性氧（ROS）水平的影响;流式细胞仪Annexin V-FITC和PI双染检了测菌体细胞凋亡;流式细胞仪PI单染法检测了菌体细胞周期的变化情况。结果:（1）黄连对痢疾杆菌的抑菌活性研究黄连对病原痢疾杆菌具有明显的抑制作用,MIC为5 mg·mL-1;对数生长期为10 h,且抑菌效果随着黄连作用时间和浓度的增加而提高。（2）黄连对痢疾杆菌细胞膜及能量代谢的影响黄连与痢疾杆菌培养10 h时,和对照组相比:2.5 mg·mL-1黄连处理组DNA、RNA大分子物质泄漏了40.1%,琥珀酸脱氢酶（SDH）和苹果酸脱氢酶（MDH）活性分别降低了21.9%、8.69%;5 mg·mL-1黄连处理组大分子物质泄漏了65.4%,SDH和MDH活性分别降低了53.9%、37.9%;10 mg·mL-1黄连处理组大分子物质泄漏了75.3%,SDH和MDH活性分别降低了68.5%、69.8%。（3）黄连对痢疾杆菌细胞壁的影响当黄连与痢疾杆菌培养10 h时,与对照组相比:各黄连处理组中的AKP含量均有很大增加,2.5 mg·mL-1黄连处理组AKP增加了62%;5 mg·mL-1黄连处理组AKP增加了77.6%;10 mg·mL-1黄连处理组AKP增加了81.4%。（4）黄连对痢疾杆菌基因组DNA及蛋白合成的影响当黄连浓度达到5 mg·mL-1时,菌体中基因组DNA与黄连中的蛋白质部分结合停留在点样孔中,且随着作用时间的延长,DNA的合成量也明显减少;黄连与痢疾杆菌培养10 h时,与对照组相比;2.5 mg·mL-1黄连处理组可溶性蛋白含量减少了35%;5mg·mL-1黄连处理组可溶性蛋白含量减少了57%;10 mg·mL-1黄连处理组可溶性蛋白含量减少了69%。（5）黄连对痢疾杆菌四种毒力因子表达的影响ipaH、dsbA、sodB和iutA四种毒力基因的表达量均下降,说明黄连可以通过抑制了这四种毒力基因的表达来降低菌体对机体的破坏。（6）黄连对痢疾杆菌菌体内活性氧（ROS）水平的影响黄连处理组中的ROS含量高于对照组,说明黄连打破了菌体内产生ROS与清除ROS系统的平衡,使菌体内ROS堆积,从而影响菌体正常生理活动的进行。（7）黄连对痢疾杆菌细胞凋亡的影响黄连处理组的凋亡率高于对照组,说明黄连诱导了菌体细胞发生凋亡。（8）黄连对痢疾杆菌细胞周期的影响黄连处理组中的G1期低于对照组,S期高于对照组,说明黄连扰乱了菌体正常的细胞周期。结论:黄连可通过改变菌体膜蛋白结构破坏菌体细胞膜,通过降低SDH和MDH活性造成细胞代谢紊乱,还可以破坏菌体细胞壁的完整性,可通过与菌体基因组DNA结合而影响菌体蛋白质的合成,可使菌体内ROS增加,可引起细胞凋亡,可造成细胞周期紊乱。