平胃散对湿阻中焦证水调激素和水转运蛋白影响的研究

实验目的:通过对模型组大鼠尿液生成调节激素,钠钾泵活性,肝脏各类水转运蛋白表达、含量、mRNA的含量、磷酸化水平的系统研究探究湿阻中焦证对肝脏Na+-K+-ATP酶活性、尿液生成调节激素、水转运蛋白的影响及平胃散干预关系,探讨平胃散是否通过影响Na+-K+-ATP酶活性,调整尿液生成调节激素失衡状态,使肝脏水转运蛋白含量、表达、活性发生变化,维持水盐平衡,揭示尿液调节激素与水转运蛋白在湿困脾胃后的作用机制,及平胃散对肝细胞跨膜物质转运功能的调控作机理。实验方法:湿阻中焦证造模后比色法测定肝脏钠钾泵活性,过氧化物酶法检测肝脏中葡萄糖含量,HPLC检测肝脏ATP含量,ELISA测定血清中各类激素和肝脏组织中SGLT1、GLUT2、NKCC1含量、PCR法测定肝脏组织SGLT1、GLUT2、NKCC1中mRNA的含量,WB法测定肝脏组织中SGLT1、GLUT2、NKCC1磷酸化水平的影响。实验结果:1湿阻中焦证模型的评估:（1）对大鼠进行一般情况观察,湿困脾胃证大鼠形体消瘦,食欲较差,饮水明显减少,嗜睡倦卧。（2）湿邪侵袭后大鼠的胃肠运动和糖吸收异常,肝脏葡萄糖不能转化利用,ATP生成减少,钠钾泵活力降低。（3）湿困脾胃后各类水转运蛋白在肝组织免疫表达异常。（4）服药治疗后,模型组大鼠宏观体征、客观指标、病理损伤、免疫功能、代谢能力都有所改善。2尿液生成激素的含量造模后,与空白组对照,湿困脾胃证大鼠肾素、血管升压素、内皮素、肾上腺素、血管紧张素Ⅱ的含量出现降低,醛固酮和利钾尿肽的含量升高;与湿困脾胃证大鼠比较,机体进行自我修复后或服用平胃散后肾素、血管紧张素Ⅱ、心房钠尿肽的含量均高于湿困脾胃证大鼠,内皮素、醛固酮、利钾尿肽、抗利尿激素、肾上腺素的含量均低于模型组;与自然恢复组比较,给予不同剂量中药治疗组中肾素、血管紧张素Ⅱ、醛固酮、心房钠尿肽的含量高于自然恢复组,给予不同剂量的中药后,肾上腺素和血管升压素的含量低于自然恢复组大鼠;服用高剂量和中剂量中药组内皮素的含量高于恢复组,服用中药中剂量组利钾尿肽的含量高于自然恢复组,服用中药低剂量组内皮素的含量低于自然恢复组,用平胃散高剂量,和低剂量灌胃后的大鼠利钾尿肽的含量明显比自然恢复组低。3肝脏水转运蛋白的表达、含量、mRNA的含量、磷酸化活性。（1）水糖协同转运蛋白免疫表达、含量、mRNA的含量、磷酸化活性变化湿困脾胃后,与正常组进行对照,湿困脾胃证大鼠肝脏中SGLT1的蛋白免疫表达出现上调,SGLT1的含量表现为降低,mRNA的含量降低,磷酸化活性降低;经过恢复后,与湿困脾胃证大鼠进行对照,恢复组肝脏中SGLT1的蛋白表达表现为上调,SGLT1的含量会降低,mRNA的含量出现降低,磷酸化活性升高;与自然恢复组比较,给予不同剂量的中药组肝脏中SGLT1的蛋白表达上调,SGLT1的含量升高,mRNA的含量升高,SGLT1磷酸化活性降低。湿困脾胃后,与空白组进行对照,湿困脾胃证大鼠肝脏中GLUT2的蛋白表达表现为下调趋势,GLUT2的含量出现降低,mRNA的含量降低,磷酸化活性降低;与湿困脾胃证大鼠进行对照,自然恢复后肝脏中GLUT2的蛋白表达出现下调趋势GLUT2的含量升高,mRNA的含量升高,磷酸化活性升高;与恢复组比较,给予不同剂量的平胃散中药后肝脏中GLUT2的蛋白表达出现下调的趋势,GLUT2的含量高,mRNA的含量升高,平胃散低剂量组肝脏中GLUT2磷酸化活性升高,平胃散高、中剂量有降低趋势。（2）水盐协同转运蛋白免疫表达含量、mRNA的含量、磷酸化活性变化造模后,与空白组进行对照,湿困脾胃证大鼠肝脏中NKCC1的蛋白表达上调,NKCC1的含量升高,mRNA的含量降低,NKCC1磷酸化活性降低。与湿困脾胃证大鼠比较,经恢复后肝脏中NKCC1的蛋白表达出现下调,NKCC1的含量会降低,mRNA的含量升高,NKCC1磷酸化活性升高,与自然恢复组比较,平胃散高剂量组肝脏中NKCC1的蛋白表达有上调趋势,平胃散中、低剂量组肝脏中NKCC1的蛋白表达有下调趋势,不同剂量中药组NKCC1的含量升高,mRNA的含量升高,平胃散高、中、剂量组肝脏中NKCC1磷酸化活性有降低趋势,低剂量中药组肝脏中NKCC1磷酸化活性有升高趋势。（3）水通道蛋白免疫表达含量、mRNA的含量、磷酸化活性变化前期实验发现,湿阻中焦后,肝脏中水通道蛋白1和水通道蛋白4的免疫表达增强,含量,mRNA的含量及磷酸化活性都降低,服用不同剂量的中药平胃散后,水通道蛋白1和水通道蛋白4的免疫表达降低,含量,mRNA的含量及磷酸化活性都升高。实验结论:湿阻中焦证不仅会影响大鼠肾素、血管紧张素、醛固酮、内皮素、血管升压素、心房钠尿肽和利钾尿肽等水液代谢激素;还会导致水转运蛋白肝脏表现异常,SGLT1、NKCC1、AQP1、AQP4免疫表达上调,GLUT2免疫表达下调;SGLT1、GLUT2、AQP1、AQP4含量会降低,NKCC1含量升高;肝脏SGLT1、GLUT2、NKCC1、AQP1、AQP4中mRNA的含量减少;SGLT1、GLUT2、NKCC1、AQP1、AQP4磷酸化水平降低;葡萄糖升高,ATP减少,钠钾泵的活力降低。这可能会是湿阻中焦发生的重要机制。平胃散能通过增强代谢率,进而增强钠钾泵活力。通过调节血清中水液代谢调节激素的平衡,调节尿量使细胞内外电解质达到平衡。同时通过调节肝脏水转运蛋白表达、含量和磷酸化活性,平衡细胞内外的离子,从而使人体的整个水液代谢趋于平衡。