粗毛纤孔菌胞外多糖对酒精肝损伤保护作用及其液体发酵条件优化

酒精是继肝炎病毒之后导致肝损害的第二大诱因,开发安全有效的药物对酒精肝损伤的预防与治疗具有重要意义。粗毛纤孔菌是一种珍贵的药用真菌,在民间常用于治疗各种肝病、胃病等,然而这些功效大多缺乏系统的实验数据来支撑,这在很大程度上限制了该菌的进一步开发和利用。多糖是粗毛纤孔菌的主要活性成分之一,在其生物活性上发挥着重要作用,但粗毛纤孔菌子实体一年生,难以快速并大量地获取,而液体发酵技术能够快速大量生产多糖物质,易于实现工业化。为促进粗毛纤孔菌的开发利用,本研究先对1株寄生于枣树的疑似粗毛纤孔菌的菌株进行种属鉴定,然后分析了粗毛纤孔菌液体发酵胞外多糖对小鼠酒精肝损伤的保护作用及药理作用机制,在明确粗毛纤孔菌胞外多糖具有改善酒精肝损伤活性后,进一步优化了粗毛纤孔菌胞外多糖发酵工艺。主要研究内容与结果如下:(1)通过形态学特征和ITS rDNA序列分析,对寄生枣树的野生疑似粗毛纤孔菌菌株进行鉴定;基于ITS1-5.8S-ITS2序列的长度、碱基构成和变异程度,对粗毛纤孔菌遗传多样性进行分析。研究结果表明,该野生菌株为粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus),其在自然界中具有丰富的遗传多样性;(2)采用液体发酵制备粗毛纤孔菌胞外多糖,用DEAE-52纤维素柱和葡聚糖凝胶柱对其进行分离纯化,得到了一多糖成分(IHEPS),然后运用HPLC、UV-Vis和FT-IR分析其理化性质。检测结果表明,IHEPS的多糖含量为98.64%,蛋白质含量为0.06%,主要由葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和氨基葡萄糖组成,对应质量百分比分别为96.19%、0.53%、0.56%、0.73%、1.75%和0.25%,其中葡萄糖是主要单糖,其骨架由α-D吡喃葡萄糖构成;(3)在明确IHEPS理化性质后,进一步探究IHEPS对小鼠急性酒精肝损伤的保护作用。采用灌胃的方式给予C57BL-6小鼠IHEPS,连续灌胃3周,最后一次给药4 h后,给予酒精造成小鼠急性酒精肝损伤,通过记录小鼠醉酒、醒酒的时间,测定血清和肝脏相关生理生化指标,分析小鼠肝脏病理切片和相关抗氧化酶的mRNA表达,来分析IHEPS对小鼠急性酒精性肝损伤的改善效果及药理作用机制。实验结果表明,IHEPS对小鼠急性酒精肝损伤有良好的保护作用,与酒精组相比,IHEPS处理组显著延长了小鼠的醉酒时间和缩短醒酒时间(p<0.05),并有效抑制了由酒精引起的肝指数、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和丙二醛(MDA)的升高,提高了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和乙醇脱氢酶(ADH)的活性;病理切片结果显示,IHEPS能够明显改善肝组织炎症细胞浸润与脂质积累,并且可以明显改善肝组织细胞的形态;研究结果还发现IHEPS能够激活Nrf2信号通路并增加下游相关抗氧化酶mRNA的表达,如NQO1,CAT和Cu-Zn SOD;(4)探究并优化粗毛纤孔菌胞外多糖的发酵生产条件。试验通过在发酵培养基中添加适量的扁桃斑鸠菊叶粉末来促进粗毛纤孔菌胞外多糖的产生,采用正交试验方案优化发酵参数。试验结果表明,显示扁桃斑鸠菊叶显著提高了粗毛纤孔菌胞外多糖产率,在最优条件下,与空白对照组相比较,添加了扁桃斑鸠菊叶的发酵组粗毛纤孔菌胞外多糖产率提高了约216.22%。本研究明确了粗毛纤孔菌胞外多糖对酒精肝损伤小鼠的保护作用,初步探明了其药理作用机制,丰富了粗毛纤孔菌胞外多糖的药理药效,同时还优化了粗毛纤孔菌胞外多糖的发酵工艺,为今后粗毛纤孔菌胞外多糖的生产及其相关产品的开发提供了理论和应用依据。