里氏木霉的复合诱变及酶系优化

纤维素酶具有非常广泛的用途,它在生物乙醇、食品加工、饲料、纺织、中医药等多个领域中都有较为重要的应用。纤维素酶作为降解纤维素和半纤维素的催化剂,在转化木质纤维素为生物乙醇的过程中起着至关重要的作用,因此选育出高产纤维素酶菌株,具有非常重要的科学前景和应用价值。其中,里氏木霉和黑曲霉在生产纤维素酶方面各具优点,因此被广泛研究。为了进一步提高纤维素酶系中各组分酶活力,本研究对里氏木霉RUT C30进行复合交替诱变,并对突变株的液体产酶培养基进行优化；另外对黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶进行优化,弥补里氏木霉生产的纤维素酶中酶系不足的缺点；最后对纤维素酶活性的环境影响因子及应用效果进行评价,主要获得结果如下：(1)采用紫外照射和甲基磺酸乙酯(EMS)对出发菌株里氏木霉(Trichoderma reesei) RUT C30的孢子悬液进行复合交替诱变。通过计算致死率,确定最佳诱变方法为紫外150s和EMS 120s重复诱变2次。对诱变后的突变菌株分别进行刚果红平板初筛和液体发酵复筛,得到一株高活性纤维素酶突变菌株ZE 7,其滤纸酶活为3.84 IU/mL,相对于原始菌株2.09 IU/mL有显著提高。经过8次连续传代培养研究其稳定性,发现突变菌株酶活性较稳定,平均值为3.74 IU/mL。(2)通过单因素及响应面实验优化里氏木霉ZE 7产酶培养基。研究得到最优产酶条件为：微晶纤维素11.15 g/L,玉米浆1 g/L,硫酸铵5.14 g/L,1 mol/L柠檬酸缓冲液75.83 mL/L。所获得的里氏木霉ZE 7滤纸酶活最高为7.79 IU/mL,较优化前提高了1.08倍,伊葡萄糖苷酶活最高为3.45 U/mL,比原有酶活(1.23U/mL)提高了1.80倍。(3)通过单因素及响应面实验优化黑曲霉C112产酶培养基。研究得到最优产酶条件为：玉米芯27.64 g/L、稻草粉25.18 g/L、硫酸铵0.76 g/L、蛋白胨0.76 g/L、1 mol/L柠檬酸缓冲液为100 mL/L时、产酶6d。所获得的黑曲霉C112伊葡萄糖苷酶活力为15.67 U/mL,较优化前酶活(7.22 U/mL)提高了1.17倍。(4)对纤维素酶活性的环境影响因子进行分析。结果表明：纤维素酶的最佳反应温度为50℃,且在该温度下酶活性稳定,高温会使酶变性失活。最佳反应pH值为5,在该pH值下酶活性稳定,过酸或过碱都会使酶失活。金属离子Fe2+、Mn2+、Zn2+、Co2+能激活纤维素酶的活性,Fe3+、Hg2+、Al3+、Pb2+、Ag+则会抑制纤维素酶的活性,而Na+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、Ca2+、K+对纤维素酶的影响不显著。(5)对纤维素酶的催化效果进行初步评价。将里氏木霉酶液与黑曲霉酶液复合并进行配比优化,通过分析复合酶对杨木的酶解糖化效果,得到最佳酶解条件为：酶用量15IU/g,β-葡萄糖苷酶／滤纸酶活力的比值1.5,酶解48 h,还原糖含量最高达到48.93 mg/mL。