泥鳅蛋白抗氧化肽的分离纯化及抗疲劳、抗癌功效研究

本文以泥鳅蛋白为原料,通过可控酶解技术制备抗氧化肽,利用体外化学模型和体内动物模型综合评价了泥鳅多肽的抗氧化活性。在此基础上利用动物模型评价其抗疲劳功效,利用细胞模型评价其抗癌功效。然后采用多种分离技术手段对泥鳅多肽进行分离纯化,并采用反相高效液相色谱联用电喷雾质谱对目标肽段进行一级氨基酸序列的鉴定,最后研究了泥鳅多肽在加工储藏过程中,以及在体外模拟胃肠道消化过程中的抗氧化活性稳定性。 泥鳅是一种高蛋白(粗蛋白含量高达17.4%)、低脂肪的食品原料,适合于蛋白酶解生产活性多肽。泥鳅蛋白水解产物的抗氧化活性与酶的种类和水解度密切相关。当水解度增加至23%时,用Papain酶解的产物显示出很强的抗氧化性,其清除?OH、DPPH?、ABTS?+自由基和还原力分别为56.08%、95.48%、2.8033 mM Trolox和1.458。采用Alcalase2.4L、Protamex、Papain、PTN6.0S、Flavorzyme500MG五种酶来水解泥鳅蛋白,发现对泥鳅蛋白进行适度酶解能提高其营养价值(除了Flavorzyme500MG酶解产物外,各产物的氨基酸分均高于泥鳅蛋白),综合比较产物的蛋白质利用率、肽得率和水解度、DPPH?、?OH和O2-?三种自由基清除能力的差异,最终选择Papain为泥鳅蛋白酶解的最佳用酶。采用响应面法优化泥鳅蛋白酶解工艺条件,得出最佳条件为:加酶量3‰(Papain活力为6×105 U/g)、酶解温度为55℃、酶解时间为4.5h,测得清除?OH的EC50值为17.00±0.54 mg/mL,与模型预测值16.76mg/mL无显著性差异(P>0.05)。 采用6种体外化学模型综合评价泥鳅多肽的抗氧化活性,结果表明泥鳅多肽具有较强的体外抗氧化活性,其清除?OH、DPPH?能力、螯合铜离子能力、抑制脂质过氧化能力分别比相同摩尔浓度的谷胱甘肽高0.4、0.46、0.78和3.11倍(泥鳅多肽的平均分子量约为谷胱甘肽的5倍)。当泥鳅多肽质量浓度为谷胱甘肽浓度的3.5倍左右时,两者还原力相当。体内抗氧化活性结果表明泥鳅多肽能使小鼠体内的抗氧化酶系——超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力分别比空白组提高了1.7%-8.5%、36%-49%和13%-27%,表明泥鳅多肽具有较强的体内抗氧化活性。 与空白对照组相比,泥鳅多肽可显著延长小鼠的力竭游泳时间达20%-28%;能延缓或减少小鼠运动时机体中葡萄糖和肝糖原的消耗,加速清除小鼠血液中乳酸和血清尿素氮的积累,还能提高小鼠体内抗氧化酶系的活力,证明泥鳅多肽可以提高小鼠游泳的耐力,具有抗疲劳功效。通过分析泥鳅多肽体内抗氧化活性与其抗疲劳功效之间的相关性,发现两者是显著相关的。 细胞实验结果表明,泥鳅多肽对肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞Caco2和乳腺癌细胞MCF-7均有显著的抑制增殖作用。随着多肽浓度的增加,抑制作用增强,其EC50值分别为16.69 mg/mL、9.92 mg/mL和15.91mg/mL。 采用超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、半制备型和分析型RP-HPLC等系列技术对泥鳅多肽进行了分离纯化,所得目标肽段清除?OH能力比分离前提高了9.14倍,也比相同摩尔浓度的GSH活性强11.6倍,说明分离纯化可显著地富集抗氧化肽。最后用RP-HPLC-ESI-MS-MS对功能肽段的氨基酸序列组成进行了鉴定,得到目标肽段的氨基酸序列为Pro-Ser-Tyr-Val,分子量464.2 Da。经肽谱库和美国化学文摘检索,该肽段为首次发现的具有显著抗氧化活性的四肽(清除?OH的EC50值为1.86±0.19mg/mL)。泥鳅抗氧化肽的稳定性研究表明泥鳅多肽的耐热性较好;耐光性较差,宜避光保存;在酸性和中性条件下其抗氧化活性变化不显著,在碱性条件下很快失活;Cu2+和Zn2+浓度的增加能显著降低其抗氧化活性(P<0.05),而Mg2+、Ca2+和K+则对其影响不显著;糖类对其抗氧化活性的影响大小先后顺序依次为:葡萄糖>蔗糖>海藻糖;冷冻和喷雾干燥方式对泥鳅肽抗氧化活性的影响不存在显著差异(P>0.05)。 在模拟胃肠道消化过程中,胃蛋白酶主要将泥鳅多肽水解成小片段,而胰酶能将泥鳅多肽水解得更加彻底(分子量小于250Da的肽段增加了110%),释放出更多的游离氨基酸。模拟消化结束后,泥鳅肽组成中有38.1%是游离氨基酸,而肽的主要组分为分子量小于500Da的肽段,验证了多肽经胃肠道消化后主要以二肽、三肽和四肽的形式被吸收,而非全部是氨基酸。与消化前的泥鳅肽相比,消化后的产物不仅抗氧化活性没有损失,而且生成了一些抗氧化活性更强的肽段,其清除?OH、ABTS?+自由基、还原力和螯合铜离子能力分别比消化前提高了12%、5%、77%和12%,说明泥鳅抗氧化肽具有较好的耐受胃肠道酶系消化的能力。