蓝莓中黄酮类物质的提取、分离纯化及生物活性研究

以蓝莓果实为原料,研究花色苷和黄酮醇的提取及分离纯化方法,并对纯化后的花色苷和黄酮醇样品进行结构鉴定及活性研究,为充分开发利用这一资源提供了科学依据。 利用超声波辅助法提取蓝莓中的花色苷和黄酮醇,采用响应面试验设计对试验条件进行优化,确定该方法的最佳条件：超声功率512.7W,超声时间29.8min,液料比为9.5：1mL/g。此条件下的理论预测黄酮醇提取量为0.804mg/g,花色苷提取量为2.899mg/g。验证试验条件：超声功率510W,超声时间30min,液料比10：1mL/g,黄酮提取量为0.806mg/g,花色苷提取量为2.903mg/g,与预测值比较吻合。 在分离纯化工艺中,采用中压柱层析法,依次选择大孔吸附树脂、Sephadex LH-20为柱填料,对蓝莓中的花色苷和黄酮醇粗提液分别进行分离纯化。通过静态试验比较了六种大孔吸附树脂对花色苷的吸附及解吸效果,筛选出D101为最佳树脂。用D101大孔吸附树脂中压柱层析法研究动态试验,得到最佳纯化条件为：选择上样液浓度为0.073mg/mL,上样体积10mL,流速5mL/min,80%乙醇溶液为洗脱液,此条件下的花色苷回收率为96.61%,大孔树脂纯化前花色苷粗提液纯度为5.53%,纯化后样品纯度为75.58%；通过静态试验比较七种大孔吸附树脂对黄酮醇吸附及解吸效果,筛选出S-8为吸附和解析性能均较佳的树脂。用S-8大孔吸附树脂中压柱层析法研究动态试验,得到最佳纯化条件为：选择上样浓度0.362mg/mL,上样体积10mL,流速2mL/min,95%乙醇溶液为洗脱液,此条件下的回收率为92.83%,大孔树脂纯化前黄酮粗提液纯度为5.03%,纯化后样品纯度为55.58%。 采用Sephadex LH-20中压柱层析法对大孔树脂纯化后的花色苷进行精细分离,得到最佳分离条件为：上样浓度为1.0mg/mL,上样体积10mL,20%、35%、50%甲醇梯度洗脱,20%甲醇时,流速1.0mL/min;35%甲醇,50%甲醇时,流速3.0mL/min,分离得到较单一的两种组分,其中对组分Ⅰ进行鉴定为矢车菊-3-葡萄糖苷,HPLC测定纯度90.88%。Sephadex LH-20中压柱层析法对大孔树脂纯化后的黄酮醇进行精细分离,得到最佳分离条件为：上样浓度1.0mg/mL,上样体积10mL,流速1mL/min,50%、70%、无水甲醇梯度洗脱,分离得到较单一的两种组分,其中对组分Ⅰ进行鉴定为槲皮素,HPLC测定纯度89.10%,组分Ⅱ初步判定可能为杨梅酮。 从反应的三个阶段进行研究蓝莓花色苷的抗非酶糖基化活性。结果表明,随着花色苷浓度的增加,抑制作用也随之增加,随着时间的延长,抑制率先增加后降低。经大孔树脂纯化后浓度为0.2mg/mL的花色苷对NBT还原实验的抑制率为11.80%,对二羰基化合物生成的抑制率为39.44%,对糖基化终产物的抑制作用在加入糖基化体系第三天时达到最大45.44%,说明花色苷对非酶糖基化具有一定的抑制作用,主要发生在中后阶段,对NBT还原实验的抑制作用不是很明显。