葛根异黄酮的发酵提取工艺及其抗氧化性研究

葛根为豆科葛属植物野葛(Pueraria lobata(Wild.)Ohwi)的根,属于“药食同源”植物,主要成分为纤维素、淀粉、异黄酮类化合物以及丰富的矿质元素等,其中葛根异黄酮(Radix pueraria isoflavones, RPI)为其主要功能性成分。RPI是一类植物雌激素,具有改善心脑血管代谢机能、抗衰老、抗癌、抗疲劳、抗氧化、增强机体免疫力以及解酒保肝等多种功能。葛根素(Puerarin)占RPI总量的50%以上,常被用作评价葛根品质的指标,并已广泛用于临床。本文考察了HPLC测定发酵液中葛根素的方法；以葛根为培养基主要原料,筛选适合发酵法提取RPI的菌种,优化了培养基组分及培养条件；采用大孔树脂对发酵产物进行纯化,比较了不同提取方法所得RPI的抗氧化活性。研究结果如下： 1、对HPLC测定发酵液中葛根素含量的方法进行考察,结果表明此法稳定性好,精密度和加标回收率均较高,葛根素含量在40～200μg/mL之间线性相关(R2=0.9996),适用于发酵液中葛根素含量的测定。 2、以葛根素提取量为指标,筛选后确定米根霉-酵母混合菌为最适发酵菌种；采用Plackett-Burman试验分析液料比、氮源和无机盐等因素对RPI产量的影响,其中液料比、蛋白胨和KH2PO4具有显著正效应,通过响应面试验对其进行水平优化。结果表明,液料比30：1、蛋白胨8.49 g/L、KH2PO4 6.89 g/L时,RPI和葛根素提取量分别可达到31.98和16.18 mg/g·DW。 3、考察了糖化温度、后发酵温度、培养基初始pH、接种比例、装液量等因素对RPI提取量的影响；在单因素试验的基础上,以RPI为指标,采用响应面试验设计,对培养基初始pH、装液量和糖化温度进行了优化,得到最佳培养条件为：初始pH 6.88、装液量80 mL、糖化温度36.2℃、后发酵温度28℃、接种比例6%：6%,在此条件下RPI和葛根素提取量分别可达到40.29和18.36 mg/g·DW。 4、比较了不同极性大孔树脂对发酵液中RPI的吸附和解吸能力,确定NKA-Ⅱ型大孔树脂效果最佳；测定了NKA-Ⅱ吸附RPI的动力学曲线,考察了不同吸附温度对RPI吸附量的影响,以及不同解吸剂浓度对RPI解吸量的影响,结果表明：最适纯化工艺为吸附时间8 h、吸附温度25℃、解吸剂60%乙醇溶液；经抗氧化试验比较,发酵法所得RPI清除DPPH和超氧阴离子自由基的活性均高于水提法和醇提法,清除羟自由基活性则相对较低。