枸杞多糖的特性、结构及生物活性评价——生物学前沿技术的应用

由于活性多糖在生命科学中的重大研究价值，所以活性多糖一直是学术界倾注极大热情的重大主题。枸杞多糖是枸杞子的主要生物活性成分。枸杞子中外驰名，但我国古老的中医药学没能与现代科学技术很好的结合，发展相对较慢，因而不得不在国际市场上让位于日韩等国，这与我国的中药大国地位极不相称。研究药食兼用的中医药，并将它发扬光大是我们的责任，本课题就是在这一背景下提出并开展的。本文在本研究室以及前人已有研究工作的基础上，继续开展对枸杞多糖的特性、结构、生物活性（抑制肿瘤、促进生长发育、降脂减肥等）的研究，并采用生物学前沿技术（激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞仪、RT-PCR等）探索枸杞多糖对细胞凋亡、基因表达、生长发育和肥胖的影响及作用机制等。同时，对本研究室开发的第三代功能食品—枸杞多糖口服液进行了调节血脂的功能评价。主要研究结果如下： 1 枸杞多糖的特性及结构表征 枸杞子粉碎后，相继经不同溶剂系统提取、真空浓缩，聚酰胺色谱柱处理，再真空浓缩，冷冻干燥，脱色，真空干燥，得枸杞多糖。枸杞多糖总得率为2.64±0.12（g/100g），纯度为94.3％±1.5％。 采用聚酰胺色谱柱对枸杞多糖进行脱除蛋白处理，结果蛋白质含量由14.7％±0.2％下降为4.7％±0.1％，聚酰胺色谱柱对枸杞多糖的回收率为98.7％±0.5％，动态吸附容量为5.2mg·g-1±0.1mg·g-1。 枸杞多糖经DEAE-cellulose（OH-）色谱柱分级，Sephadex G-200凝胶色谱柱纯化得LBP-4a。气相色谱测得LBP-4a由木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比例为4.45：1.20：1.0：0.98：0.90：0.85；原子吸收光谱测得其中钙、镁、锌、铁元素含量分别为：127.9070mg·g-1、32.3953mg·g-1、0.3845mg·g-1、0.2930mg·g-1；半乳糖醛酸含量为55.45％；蛋白质含量为3.80％。 由LBP-4a的红外光谱图知：LBP-4a中含有-COOH、-OH和-NH2或-NH-基团，糖链中含有β-D-吡喃葡萄糖；高碘酸氧化实验知LBP-4a糖链中不具有连二羟基和连三羟基结构的单糖残基：具有连二羟基结构的单糖残基：具有连三羟基结构的单糖残基=57.0：16.2：1，六碳糖残基的连接中含有1→6连接的糖苷键；通过β消去反应证明LBP-4a中多糖链和氪基酸间为-O-型连接；由激光扫描共聚焦显微镜和扫描电镜对LBP-4a结晶观察结果推测：LBP-4a结晶中同时存在分子间和分子内结合的现象，LBP-4a分子相互结合时，并不是无规则的相互缠绕形成无规线团结构，而是形成片层结构，并且LBP-4a结晶可能具有各向异性的性质。 2 枸杞多糖与人肝癌细胞QGY-7703细胞凋亡的关系 拘祀多糖的特性、结构及生物活性评价 —生物学前沿技术的运用 LBP一4具有抑制肿瘤的作用。腑实验证明用含有LBP一4 50 mg一1、100 mg·L-l、 200mg.L’，和400mg·L-l的培养液培养人肝癌细胞邻Y一7703可显著抑制其增殖;细 胞形态学观察发现LBP一4可诱导那Y一7703细胞发生凋亡，使细胞凋亡指数显著提高。 同时观察到LBP一4可引起细胞形态的改变，使凋亡细胞核浓缩变小，呈典型的凋亡 细胞形态，激光扫描共聚焦显微镜观察发现凋亡细胞的细胞核表面不平整，呈现锯 齿状。 流式细胞仪检测发现LBP--4将人肝癌细胞增殖过程阻滞于S期;同时激光扫描 共聚焦显微镜检测发现LBP一4可使QGY一7703细胞的细胞浆内钙离子浓度显著增加。 作者认为LBP一4是通过调节人肝癌细胞QGY一7703细胞浆内钙离子浓度来实现诱导细 胞发生凋亡的作用的。 3构祀多糖一4对生长发育影响的评价 LBP一4对生长发育具有明显的促进作用。连续灌胃5 mg·kg一，·d一，、10mg’比一，一， 和Zomg·ks’，.d-‘的LBP--4三周后可显著减少雌性幼鼠的体重增加量，提高食物转化 率;显著提高小鼠的耐力;减少小鼠体内的脂肪含量;增大胸腺脂数，降低肝脏指 数和脾脏指数。 摄入适量的LBP一4具有促进机体对金属元素吸收的作用，并能克服铁元素对锌 元素吸收的抑制作用，可同时提高小鼠后腿骨中的锌元素和铁元素含量，并可提高 小鼠臀部肌肉中钙元素和锌元素的含量。 4构祀多糖的降脂减肥作用、相关基因的表达 连续摄入30天20mg.kg一‘·创、40mg’ks.，.d’l和60mg地”d’，的LB卜4可显著降 低下丘脑损伤性肥胖小鼠的体重、李氏指数和脂肪指数;减小脂肪细胞体积;降低 血清Tc、TG含量，提高血清HDL含量;认为LB卜4具有调节体内脂肪蓄积的作用。 同时，通过R卜pcR分析，表明LB卜4可显著提高下丘脑损伤性肥胖小鼠脂肪组织内 aeetyl一eoA earboxylase（ Aee）口翩A的表达量，认为LBP一4是通过调节小鼠能量 代谢来调节小鼠体内脂肪蓄积量的。 5第三代功能食品一构祀多糖口服液的血脂调节作用 用16.7 mgkg一，一，、34.4mg’kg’，.d-l和50.0mg’kg-，一性个剂量的拘祀多糖口 服液灌服高血脂模型大鼠，可显著降低高血脂模型大鼠血清TC、TG含量，提高大鼠 血清HDL含量。表明构祀多糖口服液具有调节血脂的作用。此产品已获得国家卫生 部保健食品批