猪骨胶原多肽的制备及其血管紧张素转换酶抑制活性的研究

本研究以猪骨为研究对象,通过采用过氧化氢(H2O2)浸泡法提取猪骨胶原蛋白,并且采用胰蛋白酶水解制取具有血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性的胶原多肽,再利用一定的体外ACE抑制活性测定试验对酶解制得胶原多肽的ACE抑制活性进行检测,探讨利用猪骨胶原蛋白制得具有ACE抑制活性的胶原多肽的可行性。 1.首先对猪骨进行碎骨、脱脂、浸酸、浸灰、中和等预处理,使蛋白质含量达到骨料干重的85%以上；再采用H2O2浸泡法对预处理后的骨料提胶进行单因素和正交试验,以胶原蛋白提取率为指标,采用H2O2浓度、提取温度、pH、提取时间四因素三水平正交试验,得到最佳提取条件分别为：H2O2浓度0.5%、提取温度100℃、pH值8.0、提取时间7h,在最佳提取条件下,胶原蛋白提取率为86.69%。 2.采用胰蛋白酶对猪骨胶原蛋白酶解进行单因素和正交试验。水解过程中考察水解度(DH)与胶原多肽ACE抑制率间的关系。结果表明：DH与胶原多肽ACE抑制率之间存在相关性,ACE抑制率随着水解度的增减而增减。以DH和ACE抑制率为指标,采用温度、pH、底物浓度、酶底比和时间五因素四水平正交试验,确定胰蛋白酶的最佳酶解工艺条件,得到最佳酶解条件为：在温度50℃、pH值7.5、底物浓度6%、酶底比8000u/g的条件下水解6h,此时DH为10.34%,ACE抑制率为65.92%。 3.采用分子量为10kDa、3kDa的超滤离心管对猪骨胶原多肽进行超滤,将不同分子量的组分进行蛋白质浓度和ACE抑制率测定。结果表明：各组分ACE抑制活性大小顺序为：分子量小于3kDa组分>胶原多肽原液>分子量介于10kDa-3kDa>分子量大于10kDa,各组分之间均存在显著性差异(P<0.01),胶原多肽分子量范围在3kDa以下组分的蛋白质浓度最低,为30.11μg/mL,而ACE抑制率最高,达到74.79%。 4.将分子量小于3kDa的胶原多肽按4、8、10、12、16、20、25μg/ml配制为七个浓度,同时,以降血压药物卡托普利(Captopril)为对照,同样按0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8ng/ml浓度梯度配制,分别测定ACE抑制活性。结果表明：分子量小于3kDa的胶原多肽ACE抑制活性的IC50为11.73μg/mL,低于大多数文献报道的IC50值,表明胰蛋白酶酶解猪骨胶原蛋白得到的胶原多肽对ACE抑制率的IC50较低,具有较强ACE体外抑制活性；对照品ACE抑制活性的IC50为1.35×10-3μg/mL,该结果在卡托普利IC50值为7.5×10-10-2.2×10-8mol/L(2×10-4-6×10-3μg/mL)范围内,说明本实验室建立ACE抑制率测定方法具有可行性、可靠性。 5.将分子量小于3kDa的胶原多肽按浓度配制为0、10、20μg/mL,分别测定马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)浓度为5.00、4.50、4.00、3.50mmol/L时ACE的活性,根据测定的吸光度值,反应马尿酸(Hip)的生成量,确定速度(V)和底物浓度([S])的关系,建立ACE抑制动力学模型。结果表明：分子量小于3kDa.的胶原多肽与ACE的结合和底物之间呈竞争性抑制,随着胶原多肽抑制剂浓度增大,动力学参数米氏常数(Km)增大,最大反应速度(Vm)基本保持不变。 6.在模拟胃肠道消化生理作用的条件下对胶原多肽未超滤液及分子量小于3kDa的胶原多肽用消化酶分别作进一步消化处理,各处理组为：①猪骨胶原多肽+胃蛋白酶；②猪骨胶原多肽+胃蛋白酶+胰凝乳蛋白酶；③猪骨胶原多肽+胃蛋白酶+胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶,分别测定消化酶处理前和处理后胶原多肽ACE抑制率的变化,以评价胶原多肽的消化稳定性。结果表明：分子量小于3kDa的胶原多肽经过胃肠道消化酶处理后,ACE抑制率从72.83%降低为68.21%,仍然保持高活性,说明其对消化酶的水解具有一定的抗性,具有较高的消化酶稳定性。各处理组与未处理组间存在显著性差异(P<0.05),各处理组之间无统计学意义(P>0.05)。未经超滤的胶原多肽原液经过胃肠道消化酶处理后ACE活性明显降低,从58.96%降为44.81%,各处理组与未处理组、各处理组之间均存在显著性差异(P<0.05)。