目的:波棱瓜子为常见的藏药,在相关报道中,已经明确了其对肝炎的治疗功效,而总木质素部位则为波棱瓜子抗肝炎的最有效部位。波棱素是总木质素中的有效单体成分,所以本实验是基于对藏药波棱瓜子中有效成分波棱素的研究;考察其是否对免疫性肝损伤具有保护作用及其机制的初步研究。本实验中,分别选取了大鼠原代肝细胞免疫性损伤、BCG+LPS和ConA致小鼠免疫性肝损伤三种模型对波棱素的治疗效果进行验证,并进一步探讨了波棱素对ConA致免疫性肝损伤的机制。方法:(1)采用原代大鼠免疫性肝细胞的损伤模型,细胞取出后,在二氧化碳培养箱中培养16h,在超净台上给予细胞上清液脂多糖以致敏,同时给不同浓度的波棱素、联苯双脂共同培养;分别在3、6、12、24h取细胞上清液,储存于冰箱中待测。按赖氏测定法测取记录肝细胞上清液中LDH、AST、ALT的含量。(2)选用BCG+LPS导致小鼠的免疫性肝损伤:小鼠经尾静脉注射BCG(2.5 mg/kg),12d后,静脉注射脂多糖(7.5μg/只)。动物禁食12小时,取血,即刻处死,将肝脏从机体内分离出来,称量记录肝脏重量,10%多聚甲醛固定。待血液静止半小时后,每分钟3000转的转速,离心10分钟,将微黄色的血清吸出,后放入冰箱内待测。然后分别测定小鼠血清中含有的LDH、AST、ALT的含量和波棱素对小鼠肝匀浆中SOD、MDA、GSH-px的活性影响。然后对肝组织进行病理形态检测;(3)采用ConA致小鼠免疫性肝损伤:连续注射波棱素7d,之后通过尾静脉注射ConA来导致肝损伤,刀豆球蛋白剂量为20mg/kg;禁食8h后,取血,将肝脏从机体内分离出来,称量记录肝脏重量,10%多聚甲醛固定。待血液静止30min后,3000rpm,离心10min,将微黄色的血清吸出,后放入冰箱内待测。测定对小鼠体内的LDH、AST、ALT的含量高低影响和肝组织中SOD、MDA、GSH-Px的活性的影响;对肝组织进行病理形态检测;(4)免疫组化法检测波棱瓜子有效成分波棱素对ConA致小鼠免疫性肝损伤肝脏中TNF-α、iNOS、NF-κB、IL-4、IL-10、IFN-γ、SOCS1、IRF-1、STAT1的表达。结果:(1)波棱素可以降低原代肝细胞损伤上清液中各时间点的LDH、AST和ALT酶的含量,显示出波棱素可以通过降低肝细胞破裂产生的酶从而达到保肝的作用。(2)在BCG+LPS对小鼠造成的免疫性肝损伤中,测定数据说明,相比较BCG+LPS组,波棱素高低剂量可以使小鼠血清中的LDH、AST、ALT的活性有所降低,同时波棱素高低剂量组中小鼠肝匀浆的SOD和GSH-Px酶活相对于模型组有所降低,然而MDA含量却明显较模型组升高了;以上说明,波棱素可以保护肝组织,其是通过降低对肝细胞的损伤以免破坏肝脏中酶的平衡,还可以从抗氧化等方面对肝脏进行防护,以免受到BCG+LPS的影响导致免疫性肝损伤。(3)在模型ConA对小鼠造成的肝损伤中,波棱瓜子的有效成分波棱素充分体现了对肝脏的保护作用,同时与BCG+LPS实验的检测结果相似,给予波棱素组的小鼠血清中的LDH、AST、ALT的酶活相对于ConA模型有所降低,同时波棱素高低剂量中的SOD和GSH-Px酶活相对与ConA组有所降低,然而MDA活性确明显较ConA组升高;以上结果同样证明了波棱素是对肝组织具有保护功效的成分。(4)通过探讨ConA造成的免疫性肝损伤,测得数据得出波棱瓜子有效成分波棱素可以降低iNOS、IL-4和TNF-α的蛋白表达,控制相关炎性TNF-α、INF-γ、NF-kB的表达,从而起到保护肝组织的作用。说明波棱素可以调节免疫系统自身进行调节,降低细胞因子的损伤,从而来保护肝组织。结论:通过以上实验数据证明,波棱瓜子的有效成分波棱素可以对卡介苗联合脂多糖和刀豆球蛋白A导致的免疫性肝损伤有相当的防护作用。波棱素对ConA致小鼠免疫性肝损伤机理可能是从抗氧化性,抑制氧化基团对肝细胞的伤害;增强机体自身的抗氧化能力,减少炎症性细胞因子侵入肝细胞内,对肝细胞造成伤害,从而来保护肝组织,抑制TNF-α、IFN-γ和IL-4的炎性因子的释放,并且控制了NF-κB信号通路的传导。
