基于代谢组学的肝气郁结证实验与临床研究

目的 肝气郁结证的发生非常普遍,是常见的中医内科证型,据中医内科临床住院病例的抽样统计中,大约有21%左右都有肝气郁结证侯的表现。近些年来,对于肝气郁结证本质生物学基础的研究较多,基本上都是单个系统的研究,主要是自主神经功能,分子生物学,微量元素,血液流变学,血浆生化,性激素,脏器损伤与量表测试等方面,至今还少有从多系统方面来研究肝气郁结证生物学基础的,对肝气郁结证目前仍未能够全面整体地阐明其生物学基础,代谢组学是现今生物与医学界的研究热点之一,它可以对各种常见生物体内几乎所有代谢产物进行定量分析,并描述生物体内代谢物动态变化,来发现代谢物变化与生理病理相关的改变关系,通过生物整体、系统或器官代谢途径及内源性代谢物质所受的不同影响因素,来研究机体的整体与全局。 应用代谢组学研究肝气郁结证候,正是中医整体观的具体科学表现。在本研究中,我们一方面利用情志刺激法制作大鼠肝气郁结证模型,并用柴胡疏肝散进行灌胃给药,观察造模及给药前后代谢组的差异变化,另一方面在临床上筛选肝气郁结证患者,通过尿液与血液中代谢物的变化,以期从小分子代谢物组学水平来整体、系统地探讨肝气郁结证的特征代谢表型与可能存在的生物学本质,为肝气郁结证的进一步防治提供相应的理论与实验依据。 方法 30只健康SD大鼠,体重220g,随机分为3组：正常组10只(A组)、模型组10只(B组)和给药组10只(C组),除正常组外,其余组采用夹尾法造模建立大鼠肝气郁结证模型,给药组造模后给予柴胡疏肝散灌胃(0.5g/ml),每天两次,各组分别在造模前一天、成模后、给药后收集尿液与血液,通过NMR波谱仪检测,运用代谢组学的方法,观察大鼠正常与肝气郁结模型以及柴胡疏肝散干预后,尿液与血液小分子代谢物组的差异性变化谱；并通过30例临床肝气郁结证患者与30例健康人的尿液与血液代谢组学观察,从整体性角度来探寻肝气郁结证的生物学基础和生理病理机制。 结果 一、动物实验研究 (1)与正常组相比,模型组肝气郁结证大鼠尿液马尿酸3.97ppm,7.55ppm,7.85ppmα-酮戊二酸3.01ppm,2.45 ppm柠檬酸(citrate)2.57 ppm,4.10 ppm,2.88 ppm异柠檬酸(isocitrate) 3.99 ppm,2.51ppm,2.43和乌头酸(aconitate) 3.77 ppm,6.96 ppm,3.96 ppm的谱峰相对积分面积明显降低,在尿液中含量降低,肌酸酐3.05 ppm,4.07ppm,丙酮2.23 ppm,乙酸1.93 ppm,肌酸3.93 ppm,3.03 ppm,烟酸(nicotinate) 4.41 ppm,1.41 ppm和5-羟基吲哚-3-乙酸(5-hydroxyindole-3-acetate,5-HIAA) 3.03 ppm,2.91 ppm,6.63 ppm,7.15 ppm谱峰相对积分面积显著增高,在尿液中的含量升高。 (2)肝气郁结证大鼠给予柴胡疏肝散干预后,给药组代谢表型为肌酸3.93,3.03,丙酮2.23肌酸酐3.05等含量明显下降,N-氧化三甲胺4.07, TMAO 3.27,牛磺酸3.43等含量明显增高。差异性表达代谢物结果显示,在造模后升高的差异表达代谢物在给予柴胡疏肝散干预后,大多数变化显著性降低或者已无显著性,其尿液代谢表型有向正常范围回归的趋势,呈现代谢网络修复的结果。这提示柴胡疏肝散对肝气郁结模型组大鼠有一定的恢复作用。 (3)从正常组和模型组肝气郁结证大鼠血液的比较代谢主成分分析来看,肝气郁结证大鼠血液代谢表型为不饱和脂肪酸HDL(0.83),谷氨酸G1u,谷氨酰胺G1n(2.43),撷氨酸Va1(1.03,0.98),VLDL(1.29,0.87),LDL,(1.25,0.85)类脂,(1.27)等化合物含量降低,乳酸Lac(1.31,1.32,4.11),N-乙酰糖蛋白Nac(2.02,2.05,2.06,2.09),胆碱,饱和脂肪酸,B-葡萄糖(3.47,3.91)含量上升。其代谢产物标志物可能是乳酸、胆碱、Nac、饱和脂肪酸、血糖、不饱和脂肪酸、HDL。 (4)给药组肝气郁结证大鼠给予柴胡疏肝散干预后,对血液1H-NMR谱峰积分值进行PCA分析后,得到得分图(scoreplot),两组均不能区分开,说明没有找到模型组与给药组的血液代谢表型差异化合物。 二、临床研究 (1)从正常组和肝气郁结证患者组尿液的比较代谢PCA分析来看,肝气郁结证患者尿液代谢表型为柠檬酸(citrate) 2.57,2.71,2.66,苯丙氨酸(phenylalanine) 3.12,色氨酸(tryptophan) 3.32,乙酰基柠檬酸(acetyl citric acid) 1.28,1.26,酪胺(tyramine) 2.71,2.53,乌头酸(aconitic acid) 3.17 3.45,3.77等化合物含量降低,肌酐(creatinine)3.06,4.06,4.1上升。 (2)对正常组与肝气郁结证患者组血液代谢组统计分析,两组血液的代谢组学PCA分析结果可以看出正常组与肝气郁结组之间PC没有区分开来,说明肝气郁结证患者血浆内源性代谢谱变化不明显。 结论 (1)肝气郁结证反应了能量代谢水平偏低,主要代谢途径是三羧酸循环,标志代谢物为柠檬酸和乌头酸的显著性降低。 (2)肝气郁结发生机制“怒伤肝”的生物学基础为烟酸的代谢。 (3)肝气郁结的抑郁症状与色氨酸代谢降低密切相关。 (4)柴胡疏肝散能够部分调控平抑肝气郁结证中发生异常的代谢产物。 (5)“肝主疏泄”对情志的调节作用通过酪氨酸代谢发挥作用。 (6)在肝气郁结证候中氨基酸代谢表现明显。 通过以上发现的肝气郁结证候代谢产物发生变化的生物基础,得到肝气郁结证生物体生理与病理发生的代谢组变化机制,对肝气郁结证的生物特征从代谢组学整体角度进行了成功的探索。 意义：初步发现肝气郁结证生物体的生理与病理发生变化的代谢机制基础是具有整体特征的多个代谢途径。