羧甲基茯苓多糖的制备及生物活性研究

茯苓属我国卫生部颁布的食药两用资源,茯苓重要的活性成分—茯苓多糖能提高机体免疫力,具有防治肿瘤、抗炎、抗衰老等多种生物活性,具有极高的食用和药用价值。茯苓多糖主要为碱溶性多糖,因不溶于水而影响其活性的发挥。本研究以茯苓菌核为原料,提取碱溶性茯苓多糖,并对其进行羧甲基化结构修饰,制备水溶性羧甲基茯苓多糖;经醇沉、脱蛋白和柱层析分离纯化得高纯度均一多糖,通过光谱、色谱等技术分析鉴定其理化性质和结构特性;通过细胞试验和自由基清除试验评价其抗肿瘤、抗氧化活性,主要研究结论如下:(1)采用溶媒法制备了水溶性羧甲基茯苓多糖,得羧甲基取代度0.851;乙醇沉淀工艺研究试验表明,羧甲基茯苓多糖的最佳醇沉浓度为80%,多糖沉淀率可达80.43%;通过综合考察Sevag法、盐酸法和三氯乙酸法的脱蛋白率和多糖损失率,确定了以Sevag法作为羧甲基茯苓多糖的脱蛋白方法;粗多糖再经离子交换柱层析(DEAE-52 Cellulose)和凝胶柱层析(Toyopearl HW-65S)进一步分离纯化得到均一多糖,多糖含量97.81%。(2)通过高效体积排阻色谱-示差折光检测器-多角激光光散射仪(HPSEC-RIMALLS)联用法测定羧甲基茯苓多糖的重均分子量为6.453×104g/mol,并采用紫外光谱、红外光谱、热重分析、粒度分析等检测手段对其基本理化性质和结构初步分析。紫外光谱分析结果表明羧甲基茯苓多糖在280nm、400nm两处均无明显吸收峰,表明多糖样品不含有蛋白质和色素类物质。红外光谱分析结果表明,羧甲基茯苓多糖是β-D-吡喃糖,1630 cm-1和1424 cm-1处出现新的强吸收峰可证明羧甲基化成功。(3)采用MTS法对羧甲基茯苓多糖在体外抑制人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC-803和人乳腺癌细胞株MCF7的增殖作用进行了研究,结果显示,20、100和500ug/mL的羧甲基茯苓多糖对三种肿瘤细胞的生长均有一定的抑制作用,且随多糖作用剂量的增大,其对肿瘤细胞生长的抑制作用增强。500ug/mL的羧甲基茯苓多糖对HepG2、MCF7和MGC-803细胞的抑制率分别可达36.09%、48.70%和63.04%,其中MGC-803细胞生长抑制效果最明显。(4)采用微弱化学发光法研究羧甲基茯苓多糖的抗氧化活性,研究结果表明羧甲基茯苓多糖具有较强的体外抗氧化活性,其对3种自由基的清除能力依次为超氧阴离子自由基(O2-·)>过氧化氢(H2O2)>羟基自由基(·OH),IC50值分别为2.94、5.21、8.10mg/mL。