玉米赤霉烯酮单抗的制备及初步应用

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN) ,主要是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等镰刀菌产生的真菌毒素。ZEN主要污染玉米、大麦、小麦、燕麦和高粱等作物,其主要作用类似于雌激素,可导致不孕或流产,具有较强的生殖和发育毒性。ZEN还具有免疫毒性、基因毒性等,对人也有雌激素作用及可疑致癌性。近年来,因玉米发霉导致动物玉米赤霉烯酮毒素急、慢性中毒的病例屡见不鲜,因此加强对ZEN的检测,对确保食品安全具有重要意义。 目前,ZEN的的检测方法主要有薄层层析法、高效液相色谱法及免疫学方法等。薄层层析法灵敏度不高,特异性不强,易被其它荧光物质干扰,且分析时间较长;高效液相色谱法虽然灵敏度高,但检测仪器化程度高、设备昂贵,操作技术要求高,前处理净化要求高;免疫学方法由于其特异性强、灵敏度高,前处理简单,操作简便,比较容易推广使用。酶联免疫吸附法可同时检测多个样品,特异性强、灵敏度高、速度快,是一种准确性、安全性高,实用性强的检测技术。 本研究运用化学合成方法制备ZEN完全抗原,采用单克隆抗体技术制备了灵敏度高、特异性强、效价高的抗体,建立了ZEN的CiELISA测定方法。玉米样品加标回收试验证明,建立的检测玉米中ZEN的CiELISA测定方法是稳定、可靠的。 1.完全抗原的合成与鉴定。用ZEN与羧甲基羟胺半盐酸盐在吡啶中反应生成玉米赤霉烯酮肟(ZENO),再用活性酯法将ZENO与蛋白质偶联合成完全抗原。用TLC法对ZENO的转化进程进行实时监测;另外,实验用质谱检测法对合成的ZENO结构进行鉴定;用紫外扫描法鉴定每步反应的合成效果,并根据扫描结果计算载体蛋白与毒素的结合比。结果显示:经改进的方法合成过程更为简单,同时ZEN的肟化率较高,达到79.3%。紫外扫描初步判定偶联成功,两种完全抗原ZEN-BSA、ZEN-OVA的结合比分别为12:1和21:1。 2. ZEN单抗的制备。用ZEN-BSA免疫BALB/c小鼠,五免后阳性血清效价在1:10,000以上。利用单克隆抗体技术和现代细胞融合技术,经过筛选,获得一株单克隆抗体杂交瘤细胞株3F11,稳定性实验表明,这株单抗细胞株可稳定地分泌抗ZEN单克隆抗体。 3. ELISA检测方法的建立。通过建立间接竞争ELISA方法,测定腹水最佳工作浓度在1:32,000。用3F11制备的腹水作出的ZEN药物抑制标准曲线,其线性方程为:y =0.2989x-0.0292(R2=0.9898),LOD为2.16ng/ml,LOQ为22.37ng/ml。通过对同类真菌毒素的交叉反应实验表明该ZEN单抗的特异性良好,对其他真菌毒素的抑制率均小于0.5%。 4.玉米中ZEN添加回收试验。对玉米样品中的ZEN提取方法进行了优化,当提取液作8倍以上稀释时,基质干扰基本消失,且在1ng/ml～500ng/ml范围内,标准曲线的线性方程为y =0.3076x-0.05(R2=0.9931),LOD为1.9μg/kg。用50,100,500μg/kg ZEN做加标回收试验,经检ZEN回收率在72.9%～100%之间,批内差异在2.46%～5.73%之间,批间差异在4.37%～9.54%之间。